La delezione podocitaria di ADAM17 rallenta il danno glomerulare nella nefropatia diabetica

Diabetic nephropathy is one of the most important complications related to both type 1 and 2 diabetes and the leading cause of end-stage renal disease (ESRD) associated with a high mortality rate. ADAM17 (or TACE) is a member of the disintegrin metalloprotease family that appears to be involved in the pathogenesis of diabetic nephropathy in both humans and animal models. Several studies have shown an increase in the expression and activity of ADAM17 metalloproteases in the kidneys, which mediates the increase of oxidative stress, inflammation and fibrosis, favoring the progression of the damage. In order to evaluate the effects of the glomerular deletion of ADAM17, we generated a mouse model in which ADAM17 was specifically deleted in the podocyte through the crossing of animals in which the ADAM17 gene is flanked by LoxP sites, with animals that express the Cre- recombinase in the podocin. Podocin, encoded by the NPHS2 gene, is an important structural protein of the podocyte, which constitutes the glomerular filtration barrier. The thus generated ΔPodA17 animals were then identified by PCR. The successful deletion was confirmed by immunofluorescence where, using WT1 as a podocyte marker, it was possible to observe that the expression of ADAM17 is present in the controls but not in the experimental model. It was also possible to notice that this expression is increased in a condition of chronic hyperglycemia in controls compared to ΔPodA17 animals. Also the activity of ADAM17, performed on glomerular fractions, is reduced in ΔPodA17 compared to controls. At the eighth week of life, following a first basic characterization, the ΔPodA17 mice and their controls were divided into two groups: the first group was injected with STZ for the induction of diabetes, the second group was injected with sodium citrate. A week after the last injection of STZ, blood glucose was measure to verify that the animals had developed diabetes (glucose level ≥ 200mg / dl). Twelve weeks after the last injection of STZ, 24h urine was collected and then the animals were sacrificed and the explanted kidneys were used for morphological, structural and biomolecular analysis. The 24h urine was used to evaluate proteinuria by assaying the concentrations of albumin and TNF-α, which are significantly reduced in diabetic ΔPodA17 animals compared to diabetic controls. The morphometric and structural analysis performed on the explanted kidneys showed less glomerular damage in diabetic ΔPodA17 animals compared to diabetic controls. The experimental model created in our laboratory shows a significant reduction in the mean 7 glomerular area (mGA) and in fractional and mean mesangial areas (mMA and fMA), as well as a greater gene and protein expression of important structural components of the podocyte (podocin, nephrin, WT1). Furthermore, diabetic ΔPodA17 mice show a significant reduction of fibrosis and oxidative stress, assessed by immunohistochemical analysis for collagen IV, one of the main components of the extracellular matrix and for the NADPH oxidase Nox4, responsible for the ROS production, either through the analysis of gene and protein expression of ACE2, a renoprotective factor and one of the ADAM17’s substrates, These data suggest that the podocyte deletion of ADAM17 limits the onset and progression of renal complications related to diabetes, and that ADAM17 can therefore be evaluated as a therapeutic target for the treatment of diabetic nephropathy.

La nefropatia diabetica è una delle più importanti complicanze legate al diabete di tipo 1 e 2 e la principale causa di malattia renale allo stadio terminale (ESRD), associata ad un elevato tasso di mortalità. ADAM17 (o TACE), membro della famiglia delle metalloproteasi a disintegrina, sembra essere coinvolto nella patogenesi della nefropatia diabetica sia nell’uomo che nei modelli animali. Diversi studi hanno infatti dimostrato un aumento, a livello renale, dell’espressione e dell’attività della metalloproteasi ADAM17, la quale media l’incremento dello stress ossidativo, dell’infiammazione e della fibrosi, favorendo la progressione del danno. Al fine di valutare gli effetti della delezione glomerulare di ADAM17, è stato generato un modello murino in cui ADAM17 è stato deleto in maniera specifica a livello del podocita mediante l’incrocio di animali in cui il gene di ADAM17 è fiancheggiato da siti LoxP, con animali che esprimono la ricombinasi- Cre a livello della podocina. La podocina, codificata dal gene NPHS2, è una importante proteina strutturale del podocita, il quale costituisce la barriera di filtrazione glomerulare. Gli animali ∆PodA17 così generati sono stati poi identificati mendiate PCR. L’avvenuta delezione è stata confermata dall’immunofluorescenza dove, utilizzando WT1 come marcatore podocitario, è stato possibile osservare che l’espressione di ADAM17 è presente nei controlli ma non nel modello sperimentale. È stato inoltre possibile notare che tale espressione risulta aumentata in una condizione di iperglicemia cronica nei controlli rispetto agli animali ∆PodA17. Anche l’attività di ADAM17, eseguita su frazioni glomerulari, risulta ridotta nei ∆PodA17 rispetto ai controlli. All’8° settimana di vita, in seguito ad una prima caratterizzazione di base, gli animali ∆PodA17 e i rispettivi controlli sono stati suddivisi in due gruppi: ad uno è stata iniettata STZ per l’induzione del diabete, all’altro invece è stato iniettato sodio citrato. Ad una settimana dall’ultima iniezione di STZ, è stata effettuata la misurazione della glicemia per verificare che gli animali avessero sviluppato diabete (glicemia ≥ 200mg/dl). Dopo 12 settimane dall’ultima iniezione sono state raccolte le urine delle 24h e successivamente gli animali sono stati sacrificati e i reni espiantati sono stati utilizzati per l’esecuzione di analisi morfologico-strutturali e biomolecolari. Le urine delle 24h sono state utilizzate per valutare la proteinuria mediante il dosaggio delle concentrazioni di albumina e TNF-α, le quali risultano significativamente ridotte negli animali ∆PodA17 diabetici rispetto ai controlli diabetici. L’analisi morfometrica e strutturale eseguita sui reni espiantati ha evidenziato un minor danno glomerulare negli animali ∆PodA17 diabetici rispetto ai controlli diabetici. Il modello 5 sperimentale creato nel nostro laboratorio presenta infatti una significativa riduzione della media dell’area glomerulare (mGA) e delle aree media e frazionale mesangiali (mMA e fMA), nonché una maggiore espressione genica e proteica di importanti componenti strutturali del podocita (podocina, nefrina, WT1). Gli animali ∆PodA17 diabetici presentano inoltre una significativa riduzione della fibrosi e dello stress ossidativo valutate sia mediante analisi immunoistochimica per il collagene IV, uno dei principali componenti della matrice extracellulare, e per la NADPH ossidasi Nox4, responsabile della produzione dei ROS, sia attraverso l’analisi dell’espressione genica e proteica di ACE2, fattore renoprotettivo e substrato di ADAM17. I dati ottenuti suggeriscono che la delezione podocitaria di ADAM17 limita l’insorgenza e la progressione delle complicanze renali legate al diabete, e che ADAM17 può essere quindi valutato come target terapeutico per il trattamento della nefropatia diabetica.