Descrizione e caratterizzazione della specie agarolitica Sphingomonas turrisvirgatae e del suo batteriofago specifico vB_StuS_MMDA13

In this research project a bacterial strain, named MCT13, isolated during the study of the superficial aerobic community of an artificial freshwater basin located near the Experimental Ecology and Aquaculture Laboratories of the University of Rome "Tor Vergata", has been characterized. A preliminary study based on 16S rDNA sequencing led to hypothesize that MCT13 could belong to a still undescribed Sphingomonas species, in particular to the Sphingomonas cluster I (Sphingomonas sensu stricto) and showed the closest relative to be Sphingomonas koreensis. A detailed taxonomic classification of the isolate was accomplished by the analyses of polar lipids and membrane fatty acids as well as polyamines and isoprenoid quinones. The best growth conditions of the isolate were determined using the LB medium to establish the optimal temperature and pH values and the salt tolerance. Growth was observed in a temperature range between 20 and 35 °C, with optimum at 28- 30 °C, and in a pH range from 6.5 to 9.0 with optimum at 7.5. Salt concentrations are tolerated in the range 0 - 1.5%, with optimum with no salt at all. The next step was to find out a synthetic chemically defined medium to perform assimilation tests; among the tested media and different combinations of amino acids and/or vitamins, the best results were obtained with the Brunner medium (DSMZ 457) by adding L-methionine at 0.02% and glucose as carbon source to the recipe and incubating the culture at least 48 hours. MCT13 is a rod-shaped, Gram-negative, catalase positive and weakly oxidase positive, aerobic, non-spore-forming, and non-motile bacterium. Its peculiarity consists in an evident agarolytic activity, a feature never reported so far in other bacteria of Sphingomonas genus and currently known mainly in marine bacteria. This activity is more evident in nutrients-poor than in rich culture media, suggesting nutrients-related regulation mechanisms and/or associative interactions with other environmental microorganisms, indeed, the results from biochemical tests showed that MCT13 is able to assimilate only a few organic substances. The analysis of the MCT13 genome allowed to identify four agarase-encoding genes, encompassed in a region of about 65 Kbp which shares homologies mainly with marine bacteria and where gene duplications are present, supporting the hypothesis of an acquisition by horizontal gene transfer, most likely remote because it is not identified as a genomic island by IslandViewer4 analysis, despite the presence of a site-specific integrase upstream the region itself. Several genes involved in the degradation of contaminants, such as, for example, polycyclic aromatic hydrocarbons, have also been identified in MCT13 chromosome. In addition, the genome includes three plasmids of different sizes; the two larger ones being characterized by the presence of gene clusters involved in heavy metals detoxification, such as arsenic and copper. The aforementioned plasmids do not belong to any of the incompatibility groups described so far, and could be useful tools for future genetic engineering applications aimed at environmental 9 bioremediation and decontamination of anthropogenic-impacted ecosystems. The complete taxonomic characterization, through morphological, physiological analyses and genome sequencing, confirmed that the MCT13 isolate represents the type strain of a new species of Sphingomonas genus, which has been named Sphingomonas turrisvirgatae. The four agarases encoding genes have been cloned, in the pGEM vector, under control of T7 promoter; the recombinant plasmids were checked by sequencing and used to transform the Escherichia coli BL21(DE3) strain. However, it was not possible to observe any agarase activity in the new host, a result that will be the subject of further investigations. The Sphingomonas genus is a very large one, however, in recent years, an increasing number of species has been described and validated, and strains with interesting activities have been studied, even if their taxonomic position has not been clarified. This huge biodiversity creates an objective difficulty of identification at the species level, also because the biochemical profile can be influenced by the frequent presence of megaplasmids, and the 16S rDNA are extremely conserved, so that two different species, with a 100% identity in these genes, have been observed, but also the objective difficulty of obtaining a secure identification through conventional analyses. Together with the complete new species analysis, bacteriophages (or phages) specific for S. turrisvirgatae have been looked for as a rapid tool to identify and collect new isolates of this species, and as a hint for its ecology. Two phages infecting S. turrisvirgatae, have been isolated from a surface freshwater sample in a pond near Viterbo, using the "double-layer agar" technique, out of these one has been further characterized and named vB_StuS_MMDA13. The host spectrum of vB_StuS_MMDA13 was determined by the spot test technique using 13 previously characterized bacterial strains, most of them belonging to Sphingomonas genus; results from this analysis showed that the phage infects only S. turrisvirgatae. vB_StuS_MMDA13 morphology, observed by transmission electron microscopy, which showed an elongated icosahedral head and a long, flexible, helical, non-contractile tail that ends with an apparent basal plate and some fibers, puts it within Siphoviridae family, B2 morphotype. Only two phages targeting species of Sphingomonas genus have currently been described and sequenced; these phages infect Sphingomonas paucimobilis and belong to Myoviridae and Podoviridae families, respectively. Therefore, vB_StuS_MMDA13 represents the first report of phages belonging to Siphoviridae family and infecting bacteria of Sphingomonas genus. The physiological characterization of the phage was carried out by: 1) determining the infection kinetics; 2) evaluating the stability to some parameters such as pH and temperature. Regarding the first point, vB_StuS_MMDA13 has a latency period of about three hours, most likely due to the slow growth of the MCT13 host, and a burst size, i. e. the number of phages released upon the lysis of the host bacterial cell, of about 30. On the other hand, vB_StuS_MMDA13 is stable in a wide range of pH values, from 4 to 11, and of temperature, from 25 to 60 °C. The determination of vB_StuS_MMDA13 genome sequence was accomplished by a NGS 10 approach, which allowed to define a dsDNA of 63,743 bp and 87 ORFs, but no tRNAs, toxins encoding genes, antibiotic resistance determinants or elements commonly involved in a lysogenic replication cycle, were detected. Two assays were performed on a MCT13 phage-resistant mutant to detect a possible lysogeny: 1) the mitomycin C induction test; 2) the use of vB_StuS_MMDA13 specific primers targeting the terminase large subunit, a very conserved protein among phages. Both tests gave negative results, confirming the lytic nature of vB_StuS_MMDA13. The comparative analysis of the vB_StuS_MMDA13 genome with that of selected phages belonging to the Siphoviridae family, showed that vB_StuS_MMDA13 does not belong to any of the known genera of the ICTV classification. However, the lack of defined cut-off values to allow vB_StuS_MMDA13 taxonomic classification, will be the basis for future studies aimed at clarifying its position.

In questo progetto di ricerca è stato caratterizzato un ceppo batterico, chiamato MCT13, isolato durante lo studio della comunità aerobica superficiale di un bacino artificiale di acqua dolce situato in prossimità dei Laboratori di Ecologia Sperimentale e Acquacoltura dell’Università di Roma “Tor Vergata”. Uno studio preliminare basato sul sequenziamento dell'rDNA 16S ha permesso di ipotizzare che MCT13 potesse appartenere ad una nuova specie di Sphingomonas non ancora descritta, in particolare al cluster I (sensu stricto) di Sphingomonas e ha mostrato che la specie filogeneticamente più vicina è Sphingomonas koreensis. Un dettagliato inquadramento tassonomico dell’isolato è stato possibile mediante l’analisi dei lipidi polari e degli acidi grassi di membrana nonché delle poliammine e dei chinoni isoprenoidi. Le condizioni ottimali di crescita del ceppo in esame sono state determinate utilizzando il terreno LB per stabilire gli optimum di temperatura e pH e il grado di tolleranza al sale. La crescita è stata osservata in un intervallo di temperature tra 20 e 35 °C, con optimum a 28-30 °C, e in un intervallo di pH da 6,5 a 9,0 con optimum a 7,5. Le concentrazioni di sale tollerate erano comprese tra 0 e 1,5%, con optimum di crescita in assenza di sale. Il passo successivo è stato quello di trovare un terreno sintetico chimicamente definito che consentisse di effettuare i test di assimilazione. Tra i terreni sintetici sperimentati e le diverse combinazioni di aminoacidi e/o vitamine testate, i migliori risultati sono stati ottenuti con il terreno di Brunner (DSMZ 457) aggiungendo alla formula L-metionina allo 0,02% e glucosio come fonte di carbonio e lasciando la coltura in incubazione per almeno 48 ore. MCT13 è un batterio di forma bastoncellare, Gram-negativo, catalasi positivo e debolmente ossidasi positivo, aerobio, non mobile e asporigeno. La peculiarità di MCT13 consiste nel mostrare una evidente attività agarolitica, caratteristica mai osservata in altri batteri del genere Sphingomonas e finora descritta principalmente in batteri marini. Questa attività è maggiormente evidente in terreni di coltura poveri di nutrienti,suggerendo un meccanismo di regolazione correlato alla loro disponibilità e/o a interazioni di tipo associativo con altri microrganismi ambientali, infatti, dalle prove biochimiche, è emerso che MCT13 è in grado di assimilare un numero limitato di sostanze organiche. L’analisi del genoma di MCT13 ha permesso di identificare quattro geni codificanti agarasi in una regione di circa 65 Kbp, che condivide omologie principalmente con batteri marini e in cui sono presenti delle duplicazioni geniche, supportando l’ipotesi di un’acquisizione mediante trasferimento genico orizzontale, probabilmente remoto in quanto la regione non è riconosciuta come isola genomica dall’analisi con IslandViewer4. Nel cromosoma, sono stati inoltre identificati diversi geni implicati nella degradazione di contaminanti, come, per esempio, gli idrocarburi policiclici aromatici. Oltre al cromosoma, il genoma comprende tre plasmidi di diverse dimensioni, di cui i due con una massa 6 maggiore caratterizzati dalla presenza di cluster genici implicati nella detossificazione di metalli pesanti, come l’arsenico e il rame. I suddetti plasmidi non appartengono a nessuno dei gruppi di incompatibilità finora descritti e potrebbero rappresentare strumenti utili da sfruttare in futuro per applicazioni di ingegneria genetica finalizzate al biorisanamento ambientale e alla decontaminazione di ecosistemi impattati dall’uomo. La caratterizzazione tassonomica completa, attraverso le analisi morfologiche, fisiologiche e il sequenziamento del genoma, hanno confermato che MCT13 è il ceppo tipo di una nuova specie del genere Sphingomonas, a cui è stato dato il nome Sphingomonas turrisvirgatae. I singoli geni per le quattro agarasi sono stati anche clonati, nel vettore pGEM, sotto il promotore T7; i plasmidi ricombinanti sono stati controllati per sequenziamento e usati per trasformare il ceppo di Escherichia coli BL21(DE3). Non è stato tuttavia possibile osservare alcuna attività agarolitica nel nuovo ospite, un risultato che richiederà ulteriori approfondimenti. Il genere Sphingomonas, comprende moltissime specie e, negli ultimi anni, ne sono state descritte e validate molte altre; sono stati anche studiati ceppi con attività interessanti, anche se non tipizzati dal punto di vista tassonomico. Questa diversità crea un’oggettiva difficoltà di identificazione a livello di specie mediante le analisi convenzionali, anche perché il profilo biochimico può essere alterato dalla frequente presenza di megaplasmidi; inoltre i 16S rDNA sono estremamente conservati, al punto che esistono due specie diverse con un’identità del 100% in questi geni. A corredare gli studi sulla nuova specie quindi, è stata intrapresa la ricerca di batteriofagi (fagi) specifici, che ne permettano l’identificazione rapida, con lo scopo di isolare e tipizzare nuovi ceppi e comprendere meglio l’ecologia di questa specie. Due fagi capaci di infettare S. turrisvirgatae, sono stati isolati da un campione di acqua dolce superficiale in uno stagno vicino Viterbo, utilizzando la tecnica del “doublelayer agar”, e in questo lavoro ne è stato caratterizzato uno, chiamato vB_StuS_MMDA13. Lo spettro d’ospite di vB_StuS_MMDA13 è stato determinato, in via preliminare, mediante la tecnica a spot utilizzando 13 ceppi batterici precedentemente caratterizzati, di cui la maggior parte appartenenti al genere Sphingomonas; da questo test è emerso che il fago infetta solo S. turrisvirgatae. La morfologia del fago vB_StuS_MMDA13, osservata mediante la microscopia elettronica a trasmissione che ha mostrato un capside icosaedrico oblungo, una lunga coda flessibile, elicoidale, non contrattile che termina con un’apparente piastra basale e alcune fibre lo colloca nel morfotipo B2 della famiglia Siphoviridae. Attualmente sono stati descritti e sequenziati solo due fagi attivi nei confronti di una specie del genere Sphingomonas, questi fagi infettano Sphingomonas paucimobilis e appartengono alle famiglie Myoviridae e Podoviridae, rispettivamente. Pertanto, vB_StuS_MMDA13 rappresenta il primo report di fagi appartenenti alla famiglia Siphoviridae e infettanti batteri del genere Sphingomonas. La caratterizzazione fisiologica del fago è stata effettuata mediante: 1) la determinazione della cinetica di infezione; 2) la valutazione della stabilità ad alcuni parametri come il 7 pH e la temperatura. Per quanto riguarda il primo punto, vB_StuS_MMDA13 ha un periodo di latenza di circa tre ore, probabilmente legato alla crescita lenta dell’ospite MCT13, e un volume di scoppio, ossia il numero di fagi liberati in seguito alla lisi della cellula batterica ospite, di circa 30. Relativamente al secondo punto, vB_StuS_MMDA13 è stabile in un ampio intervallo di valori di pH, da 4 a 11, e di temperatura, da 25 a 60 °C. La determinazione della sequenza genomica è stata fatta con un approccio di Next Generation Sequencing (NGS) che ha permesso di definire un dsDNA di 63743 bp e 87 Open Reading Frames (ORFs); non sono stati invece rilevati tRNA, geni codificanti tossine, determinanti di resistenza agli antibiotici o elementi comunemente associati ad un ciclo replicativo di tipo lisogenico. Sono stati effettuati due saggi su un mutante di MCT13 resistente all’infezione di vB_StuS_MMDA13, per escludere una possibile lisogenia: 1) il test di induzione con la mitomicina C; 2) l’utilizzo di primers specifici per vB_StuS_MMDA13, che riconoscono la subunità maggiore della terminasi, una proteina molto conservata nei fagi. Entrambe le prove hanno dato esito negativo, confermando la natura litica del fago. L’analisi comparativa del genoma di vB_StuS_MMDA13 con quello di fagi selezionati appartenenti alla famiglia Siphoviridae, ha evidenziato come vB_StuS_MMDA13 non appartenga a nessuno dei generi riconosciuti dal Comitato Internazionale sulla Tassonomia dei Virus (ICTV). Tuttavia, la mancanza di valori definiti di cut-off per consentire la classificazione tassonomica, costituirà la base per studi futuri volti a chiarirne la posizione.