Nuovi approcci formulativi per ridurre l’impatto ambientale dell’inseminazione artificiale nell’allevamento suino

The development of the global pig farming industry relies on artificial insemination. This technique is applied in most pig production industries worldwide to optimize and control the quality of swine products. It is based on the dilution of seminal fluid in an aqueous solution containing various substances that increase the volume and number of semen doses while maintaining sperm cell viability. To control bacterial growth, the formulation is enriched with antibiotics. However, the use of antibiotic cocktails within semen extenders may increase the risk of antibiotic resistance in bacterial strains, which could significantly impact human health. Given this premise, the first part of this thesis focused on developing an eco-sustainable, antibiotic-free semen extender formulation. To create the product, two natural eco-sustainable substances a protein and a polypeptide were selected. These substances were incorporated at different concentrations into a base antibiotic-free formulation. Analyses were performed on sperm motility and the total bacterial load of semen samples diluted in these formulations. The final concentrations of both biomolecules that positively passed motility tests and bacterial growth containment were tested for cytotoxicity directly on boar spermatozoa and uterine cells using the MTT assay, showing no toxicity at the selected concentrations. The formulation was thus named Eco01. To evaluate its effect on the sperm plasma membrane, atomic force microscopy (AFM) scans were performed throughout the storage period. Results indicated that, unlike other commercial formulations, Eco01 did not significantly alter the structure of the sperm plasma membrane. Finally, in vivo experiments demonstrated that the Eco01 formulation did not affect the fertilizing capacity of spermatozoa compared to a commercial formulation containing antibiotics. Animal welfare is another crucial factor in the pig production industry. Surgical castration of piglets is a common practice aimed at maintaining pork acceptability for consumers by lowering the level of sex hormones present in the meat. Often, this procedure is performed without analgesia or anaesthesia due to the high costs for farms. To address this issue, the second part of this project aimed to preliminarily test the effect of molecules capable of inducing stress in sperm cells to disrupt the equilibrium of the sperm population, favouring X chromosome-bearing cells over Y chromosome-bearing cells. The molecules tested as a model included bisphenol A, lipopolysaccharide, taxol, and sodium nitroprusside. Sperm motility kinetic parameters were analysed within a boar semen extender. Additionally, the effect of pH variation in the extender solution was evaluated. The data revealed that at higher concentrations, all substances significantly inhibited the kinetic parameters, primarily due to head-to-head agglutination and inhibition of cellular metabolic activities, as confirmed by MTT metabolic activity assays. The effects of these substances could potentially be used as a selective depowering strategy for Y chromosome-bearing cells, supporting the future development of a boar semen extender capable of sperm sex-sorting. A six-month industrial research period was also conducted. During the first phase, a method was developed to improve component distribution in the powder formulation, ensuring a more homogeneous dosage in the semen extender dispensing units. To achieve this, an aqueous solution of the protein in Eco01 was sprayed directly onto the formulation’s major powder component (crystalline sucrose). To evaluate the method’s feasibility, a food-grade dye’s distribution on the same powder was studied first. Once experimental conditions were optimized, tests were conducted with the target substance. The homogeneity of the resulting powder mixture reached 83 ± 3%. The second phase of the industrial research period focused on homogenizing mixtures containing a low dose of antibiotics compared to semen extenders currently used in artificial insemination. The company had encountered challenges in reducing antibiotic content due to uneven distribution during industrial-scale formulation, leading to component aggregation. Initially, a new quantification method based on gentamicin derivatization and subsequent UV/Vis analysis was designed and validated. Binary mixing trials were then conducted to create ordered (adhesive) mixtures by leveraging particle interactions, including their size distribution. These trials optimized procedures for introducing raw materials into the industrial mixer, ensuring that gentamicin distribution in commercial units fell within the optimal production range (±20% of the nominal gentamicin value).

Lo sviluppo dell’industria suinicola mondiale è basato sull’inseminazione artificiale. Questa tecnica è applicata nella maggioranza delle industrie suine mondiali al fine di ottimizzare e controllare la qualità del prodotto suinicolo e si basa sulla diluizione del liquido seminale in una soluzione acquosa contenente diverse sostanze con la funzione di aumentare il volume e il numero delle dosi seminali e di mantenere vitali le cellule spermatiche. Per controllare la crescita batterica e la formulazione viene arricchita con antibiotici. Tuttavia, l’utilizzo di cocktails di molecole antibiotiche all’interno del diluitore seminale può accentuare il pericolo di insorgenza di antibiotico resistenza per ceppi batterici che potrebbero avere un grosso impatto sulla salute umana. Data questa premessa, la prima parte di questa tesi ha riguardato lo sviluppo di una formulazione eco sostenibile di un diluitore seminale senza antibiotici. Al fine di sviluppare il prodotto sono state selezionate due sostanze ecosostenibili di origine naturale una proteina e un polipeptide. Queste sostanze sono state inserite a diverse concentrazioni all’interno di una formulazione base senza antibiotici. Sono state condotte e analisi di motilità degli spermatozoi e la valutazione della carica batterica totale di campioni seminali diluiti nelle formulazioni. La concentrazione finale per entrambe le biomolecole che positivamente hanno superato le prove di motilità e di contenimento della crescita batterica sono state testate mediante esperimenti di citotossicità direttamente su spermatozoi di verro e su cellule uterine mediante saggio MTT, risultando in una non tossicità delle biomolecole alle concentrazioni selezionate. La formulazione è stata quindi nominata Eco01. Al fine di valutare anche la loro incidenza sulla membrana plasmatica degli spermatozoi sono stati effettuate scansioni mediante microscopia a forza atomica durante tutta la durata della conservazione, con in risultato che la formulazione Eco01, diversamente da altre formulazioni in commercio, non alterava significativamente la struttura della membrana plasmatica degli spermatozoi. Infine, esperimenti condotti in vivo, hanno dimostrato che formulazione Eco01 non modificava la capacità fecondante degli spermatozoi rispetto ad una formulazione commerciale contenente antibiotici. Nelle industrie di produzione suina il benessere animale rappresenta un altro fattore di grande importanza. In particolare, la castrazione chirurgica dei suinetti è una pratica comune nelle industrie di produzione suina, finalizzata a non alterare l’accettabilità della carne suina al consumatore abbassando il livello di ormoni sessuali presenti in essa; spesso, la castrazione chirurgica viene condotta senza l’utilizzo di analgesia ed anestesia a causa dell’elevato costo di queste pratiche per gli allevamenti. A questo proposito, la seconda parte di questo progetto prevedeva di testare in via preliminare l’effetto di molecole in grado indurre stress nelle cellule spermatiche al fine di sbilanciare l’equilibrio della popolazione spermatica favorendo la sub-popolazione delle cellule con il cromosoma X rispetto a quelle con il cromosoma Y. Come molecole modello sono state testate il bisfenolo A, lipopolisaccaride, tassolo e sodionitroprussiato. Sono stati analizzati i parametri cinetici di motilità delle cellule spermatica all’interno di un diluitore seminale suino. Inoltre, è stato valutato anche l’effetto della variazione del pH della soluzione del diluitore. I dati ottenuti rivelano che alle più alte concentrazioni tutte le sostanze inibiscono significativamente i parametri cinetici come diretta conseguenza dell’inibizione del moto cellulare mediante agglutinazioni testa-testa e di inibizione delle attività metaboliche cellulari, dati che sono stati riscontrati anche nei saggi di attività metabolica (saggio MTT). L’effetto di queste sostanze potrebbe essere usato come strategia di depotenziamento selettiva per le cellule aventi il cromosoma Y per lo sviluppo futuro di un diluitore seminale suino in grado di determinare il sessaggio delle cellule. Inoltre, è stato condotto un periodo di ricerca industriale di sei mesi. Durante la prima fase di questo periodo è stato sviluppato un metodo per migliorare la distribuzione dei componenti nella formulazione in polvere rendendo più omogenee le dosi delle unità di dispensazione del diluitore Con questo obiettivo, è stata studiata la possibilità di disperdere, la proteina presente nella formulazione Eco01 spruzzandone una soluzione acquosa direttamente sulla polvere del componente presente in maggior quantità nella formulazione stessa (saccarosio cristallino). Per valutare la fattibilità del metodo dapprima è stata studiata la distribuzione di un colorante alimentare sulla stessa polvere ed una volta ottimizzate le condizioni sperimentali sono state effettuate le prove con la sostanza d’interesse. Il grado di omogeneità della miscela in polvere così ottenuta si attestava all’83 ± 3%. La seconda fase del periodo di ricerca industriale ha riguardato l’omogenizzazione di miscele contenenti una bassa dose di antibiotici rispetto ai diluitori seminali attualmente in uso nell’inseminazione artificiale suina. Infatti, il problema riscontrato dall’azienda nella riduzione del contenuto degli antibiotici riguardava la loro distribuzione nelle formulazioni su scala industriale, che portava ad un’aggregazione dei singoli componenti. Preliminarmente, un nuovo metodo di quantificazione basato sulla derivatizzazione della gentamicina e la sua successiva lettura in UV/Vis è stato progettato e validato. Successivamente sono state condotte prove di miscelazione binaria con l’obiettivo di costruire miscele ordinate (adesive) sfruttando l’interazione fra le particelle anche basata sulla loro distribuzione dimensionale. Queste prove hanno permesso di ottimizzare le procedure di ingresso delle materie prime all’interno del miscelatore utilizzato per la produzione su scala industriale. Ciò ha consentito di portare la distribuzione della gentamicina nella unità di vendita all’interno dell’intervallo ottimale di produzione (± 20 % del valore nominale di gentamicina).