Progressi nella Leishmaniosi Canina: Interazioni Ospite-Patogeno, Risposta Immunitaria e Innovazioni Diagnostiche

The present thesis provides original data on the potential protective role of L. tarentolae and Wolbachia against CanL by modulating cytokines production towards a Th1 phenotype under in vitro and in vivo conditions. The thesis also reports a standardization of a lab-on-chip real-time PCR for the detection of L. infantum DNA in canine biological samples, ready to use as it bypasses the genomic extraction step. This thesis is structured in three chapters following the format of a “thesis by publication” encompassing articles published in international peer reviewed journals and manuscripts submitted. Chapter 1 is entitled In vitro capability of Leishmania tarentolae to survive in canine mononuclear cells and is focused on the capability of L. tarentolae to infect primary canine macrophage cells. In this chapter it is demonstrated that the above Leishmania sp. persists, but not to replicates, in dog cells until at least 96h of infection. Chapter 2 is entitled In vitro and in vivo evaluation of the canine immune response modulation by co-infections of Leishmania infantum and other pathogens, and is focused on to the potential immune effect of Wolbachia and L. tarentolae towards L. infantum infection in naturally and in experimentally infected dogs, respectively. This chapter is subdivided in four sections. Section 1 illustrates the potential role of Wolbachia, associated with Dirofilaria immitis, in modulating canine immune response against L. infantum, in naturally co-infected dogs. Sections 2 and 3 evaluate the potential protective effect that L. tarentolae may exert against L. infantum when in co-infection in primary canine macrophage cells as inferred by the increased pro-inflammatory cytokines gene expression. Section 4 describes L. tarentolae as a potential surrogate pathogen and/or immune-prophylaxis/immune-therapy against Leishmania infection. Chapter 3 is entitled Advances in the point-of-care diagnostic of canine leishmaniasis and illustrates a new diagnostic tool based on lab-on-chip technology that detects L. infantum DNA in naturally infected dogs from extracted and non-extracted biological samples. Finally, the general discussion of this doctoral thesis highlights the potential protective effect exerted by the non-pathogenic L. tarentolae against CanL when in co-infection. Indeed, the main results describe the potential capability of L. tarentolae to modulate the canine immune response, under in vitro and in vivo conditions. Thus, the findings emphasize the usefulness of L. tarentolae as a surrogate pathogen and vaccine candidate against leishmaniasis. The thesis also illustrates the high sensitivity of a reliable point-of-care diagnostic tool based on a lab-on-chip system, which bypasses the DNA extraction step, representing an advancement in the diagnosis for CanL.

La presente tesi fornisce dati originali sul potenziale ruolo protettivo di L. tarentolae e Wolbachia contro CanL modulando la produzione di citochine verso un fenotipo Th1 in condizioni in vitro e in vivo. La tesi riporta anche una standardizzazione di una PCR in tempo reale lab-on-chip per il rilevamento del DNA di L. infantum in campioni biologici canini, pronta all'uso in quanto bypassa la fase di estrazione genomica. Questa tesi è strutturata in tre capitoli seguendo il formato di una "tesi per pubblicazione" che comprende articoli pubblicati su riviste internazionali peer-reviewed e manoscritti presentati. Il capitolo 1 è intitolato Capacità in vitro di Leishmania tarentolae di sopravvivere nelle cellule mononucleari canine ed è incentrato sulla capacità di L. tarentolae di infettare le cellule macrofagiche canine primarie. In questo capitolo viene dimostrato che la suddetta Leishmania sp. persiste, ma non si replica, nelle cellule canine fino ad almeno 96 ore dall'infezione. Il capitolo 2 è intitolato Valutazione in vitro e in vivo della modulazione della risposta immunitaria canina tramite co-infezioni di Leishmania infantum e altri patogeni, e si concentra sul potenziale effetto immunitario di Wolbachia e L. tarentolae nei confronti dell'infezione da L. infantum nei cani infetti naturalmente e sperimentalmente, rispettivamente. Questo capitolo è suddiviso in quattro sezioni. La sezione 1 illustra il potenziale ruolo di Wolbachia, associato a Dirofilaria immitis, nella modulazione della risposta immunitaria canina contro L. infantum, nei cani infetti naturalmente. Le sezioni 2 e 3 valutano il potenziale effetto protettivo che L. tarentolae può esercitare contro L. infantum quando in co-infezione nelle cellule macrofagiche canine primarie come dedotto dall'aumentata espressione genica delle citochine pro-infiammatorie. La sezione 4 descrive L. tarentolae come potenziale patogeno surrogato e/o immunoprofilassi/immunoterapia contro l'infezione da Leishmania. Il capitolo 3 è intitolato Progressi nella diagnostica point-of-care della leishmaniosi canina e illustra un nuovo strumento diagnostico basato sulla tecnologia lab-on-chip che rileva il DNA di L. infantum nei cani naturalmente infetti da campioni biologici estratti e non estratti. Infine, la discussione generale di questa tesi di dottorato evidenzia il potenziale effetto protettivo esercitato dalla L. tarentolae non patogena contro la CanL quando in co-infezione. In effetti, i risultati principali descrivono la potenziale capacità della L. tarentolae di modulare la risposta immunitaria canina, in condizioni in vitro e in vivo. Pertanto, i risultati sottolineano l'utilità della L. tarentolae come agente patogeno surrogato e candidato vaccino contro la leishmaniosi. La tesi illustra anche l'elevata sensibilità di uno strumento diagnostico point-of-care affidabile basato su un sistema lab-on-chip, che bypassa la fase di estrazione del DNA, rappresentando un progresso nella diagnosi della CanL.