Ingegnerizzazione di cutinasi per la degradazione di poliesteri e poliammidi mediante approcci integrati sperimentali e computazionali

Plastic pollution has become one of the most pressing global environmental challenges, driving the search for sustainable solutions. Among these, biocatalysis offers a promising alternative to chemical recycling methods, enabling the degradation of plastics into reusable monomers with minimal environmental impact and aligning with the goals of the circular economy. This study focuses on the potential applications of cutinases, a versatile class of enzymes able to degrade solid polyesters. First, we investigated the catalytic properties of a eukaryotic and a bacterial enzyme, F. solani pisi cutinase and the Leaf and branch Compost Cutinase (LCC), respectively. These proteins were produced and characterized in their wild-type form. Several variants were specifically designed to evaluate the effect of mutations on enzymatic activity and substrate interaction. The study combined experimental techniques with computational modeling, including molecular dynamics and docking simulations, to provide a detailed understanding of the interaction of the enzymes with different substrates. Interestingly, cutinases share the catalytic triad with amidases but do not exhibit the same activity profile. This work explores whether limitations in amidase activity arise from low affinity of the amides for the active site or changes in the activation energy of the catalytic process. A combination of experimental assays, inhibition studies with amides, and quantum mechanical analyses revealed that multiple factors concur to the lack of amidase activity in cutinases. In parallel, a bioinformatics approach was developed to exploit the sampling of the sequence space performed by evolution throughout the ages. Seven LCC mutants were designed to improve its activity toward amidic substrates. While these mutants did not display amidase activity on a commercial polyamide, computational methods showed improved binding affinity. The development of this study will require the application of quantum mechanics to verify the impact of mutations on the reaction profile. Additionally, the study provides a comparative analysis of the substrate specificities of three cutinases, underscoring their individual strengths and limitations and offering insights into their possible applications for plastic degradation. A significant aspect of this research is the integration of computational tools, which complemented the experimental results. To predict specificity and affinity across a wide range of enzyme-substrate combinations, an automated computational workflow was developed in collaboration with ESTECO. This approach offers a powerful platform to match a specific substrate with the ideal enzyme for biocatalysis and its scalability allows its extention to a diverse range of biochemical systems and industrially relevant processes. This PhD thesis highlights the benefits of a synergistic approach between experimental and computational methods to optimize cutinase enzymes for plastic recycling.

L'inquinamento da plastica è una delle sfide ambientali che più urgentemente hanno bisogno di essere affrontate. La ricerca sta cercando di individuare soluzioni sostenibili ed efficienti. Tra queste, la biocatalisi offre un'alternativa promettente ai metodi chimici di riciclo, consentendo una degradazione più sostenibile e permettendo il recupero dei monomeri, in linea con i principi dell’economia circolare. Questo studio si concentra sulle cutinasi, una classe di enzimi nota per la capacità di degradare poliesteri solidi. In questa tesi vengono analizzate le proprietà catalitiche di due cutinasi, quella da F. solani pisi e la Leaf and Branch Compost Cutinase (LCC). Sono state prodotte e caratterizzate nella loro forma wild-type. Inoltre, numerose varianti sono state selezionate per valutare l’effetto delle mutazioni sull’attività enzimatica e sull’interazione con il substrato. Questo studio ha adottato tecniche sia sperimentali che computazionali, come la dinamica molecolare e il docking, per permettere una comprensione dettagliata dell’interazione enzima-substrato. Una caratteristica interessante delle cutinasi è la condivisione della triade catalitica con le amidasi, nonostante i diversi profili di attività. In questo lavoro si è indagato se l’assenza di attività amidasica fosse causata da una bassa affinità con le ammidi o da diverse energie di attivazione coinvolte nella catalisi. Una combinazione di saggi sperimentali, studi d’inibizione con substrati ammidici e analisi quantomeccaniche hanno rivelato che sono molti i fattori che causano questa mancanza di attività. Parallelamente, un approccio bioinformatico è stato sviluppato per capire le differenze tra cutinasi e amidasi, ispirandosi a come si sono evoluti questi enzimi. Sette mutanti di LCC sono stati disegnati per migliorare l’attività amidasica. Sebbene questi mutanti non abbiano mostrato un miglioramento della capacità di degradare una poliammide commerciale, le simulazioni di docking hanno mostrato un miglioramento dell’affinità. Lo sviluppo di questo studio richiederà l’uso di calcoli quantomeccanici per verificare l’effetto delle mutazioni sul profilo di reazione. Inoltre, in questo lavoro di tesi è stata effettuata un’analisi comparativa di tre cutinasi, analizzando la loro specificità per diversi substrati e individuando i loro punti di forza e limiti al fine di utilizzarle in processi di degradazione di plastiche. Per prevedere la specificità e l’affinità di enzimi su numerosi substrati, un workflow computazionale automatizzato è stato sviluppato in collaborazione con ESTECO. Questo approccio consente di individuare l’enzima ideale per un substrato specifico e la sua scalabilità lo rende applicabile su sistemi biochimici diversi di potenziale interesse industrialee. In questa tesi di dottorato sono stati evidenziati i benefici di un approccio sinergico che integra metodi sperimentali e computazionali per ottimizzare cutinasi da usare nel riciclo della plastica.