Metagenomic analysis of fecal microbiome in patients with Parkinson’s disease for potential diagnostic and prognostic use

Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease due to a progressive neuronal death in the substantia nigra caused by the aggregation and deposition of misfolded α-synuclein,in the dopaminergic neurons in the substantia nigra of the central nervous system. The standard diagnosis is based on clinical observations of the classic motor symptoms due to the dopaminergic neuronal loss, such as resting tremor, bradykinesia, rigidity, and postural instability, recently associated to nuclear imaging biomarkers. 80% of PD patients also present gastrointestinal symptoms, frequently occurring years before the motor symptoms due to CNS degeneration. This suggests an association between PD pathogenesis and the gastrointestinal tract. The brain and the gut are known to be linked by a bidirectional communication based on neuronal, immunological and humoral stimuli, called the gut-brain axis. A very important role in the gut is carried out by the microorganisms residing in the gut of the human body, known as the gut microbiota. The intestinal microbiota modulates immune response and neural response through the production of metabolites and neurotransmitters. In recent years, the hypothesis of an association between gut microbiota and Parkinson’s disease has gained importance, although it has not been possible to define a specific microbiota composition as a predictive biomarker of this disease. Ten studies have investigated microbiota composition in PD patients, obtaining contradictory results. The studies were carried out in different regions of the world and with different methods. In this thesis project, a selected population of PD patients from Central Italy has been enrolled to study the fecal microbiota composition in comparison with a healthy control group. Since microbiota composition is heavily influenced by external factors, such as diet and lifestyle habits, the weight of specific confounders and predictors was also examined and a statistical model was developed to isolate only microbial alterations associated with the pathological status. 152 fecal samples were collected from 80 patients and 72 healthy controls. Patients were enrolled according to tight inclusion criteria and information about general data, diet and lifestyle habits were collected. Microbiota composition was studied through 16s ribosomal RNA gene amplicon sequencing analysis. Age, loss 8 of weight, and sex were recognized as confounding factors, whereas PD-status, age, Body Mass Index, “eat cereals”, “gain of weigth” and “physical activity” as predictors. The presence of Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae and Enterococcaceae families were significantly higher in feces from PD patients compared to healthy controls, while Lachnospiraceae were significantly reduced. Lower levels of Lachnospiraceae and higher levels of Enterobacteriaceae families also correlated with increased disease severity and motor impairment (Hoehn & Yahr stage, MDS-UPDRS Part III). At the genus level, Citrobacter, Enterococcus, Lactococcus, Klebsiella, Salmonella, Shigella and an unclassified Enterobacteriaceae were more abundant in PD, whilst the Roseburia genus was more abundant in HC. Excluding patients under treatment with COMT inhibitors from the analysis led to a reduction in the statistical significance of several taxa, namely the family of Enterococcaceae and the genera of Citrobacter, Shigella, Enterococcus, Salmonella and Roseburia, suggesting that the abundance of these taxa is influenced by the drug. Predictive metagenomics indicated a significant variation of genes involved in the metabolism of short chain fatty acids and amino acids, and in lipopolysaccharide biosynthesis, all pathways associated with inflammation, intestinal barrier integrity and homeostasis. The identification of specific microbial taxa and metabolites may provide novel biomarkers to integrate with the current diagnostic approach and even as prognostic tools.

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia degenerative che comporta una progressiva morte neuronale a livello della substatia nigra, causata dall’aggregazione e il deposito di α-sinucleina nei neuroni dopaminergici della substantia nigra nel sistema nervoso centrale. La diagnosi si basa prevalentemente sull’osservazione clinica dei sintomi motori classici dovuti alla perdita di neuroni dopaminergici, come bradicinesia, rigidità, instabilità posturale, recentemente associati a biomarcatori di imaging nucleare. Nell’80% dei casi, i pazienti PD presentano anche sintomi gastrointestinale, spesso insorti anni prima della comparsa dei sintomi motori associati alla degenerazione neuronale. Questo suggerisce un’associazione tra la patogenesi del PD e il tratto gastrointestinale. Il cervello e l’intestino sono collegati da un sistema di comunicazione bidirezionale che coinvolge stimoli nervosi e immunologici, noto come l’asse intestino-cervello. Un ruolo fondamentale in questo asse è ricoperto dai microorganismi che risiedono nell’intestino umano, che prendono il nome di microbiota intestinale. Il microbiota intestinale modula la risposta immunitaria e neuronale grazie alla produzione di metaboliti e neurotrasmettitori. Negli ultimi anni, l’ipotesi di un’associazione tra microbiota intestinale e il morbo di Parkinson ha guadagnato importanza, anche se non è ancora stato possibile identificare una specifica composizione microbica come marcatore predittivo della malattia. Dieci studi hanno recentemente investigato la composizione del microbiota intestinale nei pazienti con PD, ottenendo risultati contraddittori. Questi studi sono stati condotti in diverse regioni del mondo e con metodi diversi. In questo progetto di tesi è stata selezionata una popolazione di pazienti PD dell’Italia centrale per studiarne la composizione del microbiota fecale confrontandola con quella di un gruppo di controlli sani. Dal momento che la composizione del microbiota intestinale è molto influenzata da fattori esterni, come la dieta e lo stile di vita, il peso di specifici confonditori e predittori è stato esaminato ed è stato sviluppato un modello statistico per isolare le alterazioni di composizione microbica dovute al solo stato di patologia. 152 campioni fecali sono stati prelevati da 80 pazienti e 72 controlli sani. I pazienti sono stati selezionati in base a criteri di inclusione rigidi e per tutti i partecipanti sono state raccolte informazioni su dati generali, dieta e stile di vita. 6 La composizione microbica è stata studiata mediante sequenziamento del gene codificante per l’RNA ribosomiale 16S. Età, perdita di peso e genere sono stati identificati come fattori confondenti, mentre stato di patologia (PD), età, indice di massa corporea (BMI), “mangiare cereali”, acquisto di peso e attività fisica sono stati identificati come predittori. L’abbondanza delle famiglie Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae e Enterococcaceae è significativamente maggiore nelle feci dei pazienti PD rispetto ai controlli sani, mentre l’abbondanza della famiglia Lachnospiraceae è ridotta. Livelli inferiori di Lachnospiraceae e maggiori di Enterobacteriaceae sono stati correlate ad una maggiore gravità della patologie e della compromissione motoria. Al livello di genere, Citrobacter, Enterococcus, Lactococcus, Klebsiella, Salmonella, Shigella ed Enterobacteriaceae non classificate sono più abbondanti nei PD, mentre Roseburia è più abbondante nei controlli. L’esclusione dall’analisi di pazienti trattati con inibitori di COMT ha portato ad una riduzione delle differenze di alcuni taxa (la famiglia Enterococcaceae e i generi Citrobacter, Shigella, Enterococcus, Salmonella e Roseburia), suggerendo che l’abbondanza di questi taxa sia influenzata da questi farmaci. L’analisi di predizione funzionale ha rilevato una variazione significativa nei geni coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi a catena corta, degli aminoacidi e della biosintesi di lipopolisaccaridi. Tutti questi pathway sono coinvolti nell’infiammazione, nell’integrità e nell’omeostasi della barriera intestinale. L’identificazione di taxa e metaboliti specifici potrebbe permettere l’identificazione di nuovi biomarcatori da integrare con l’attuale approccio diagnostico e persino da utilizzare come strumenti prognostici.