Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a disease with a highly poor prognosis due to the high risk of metastasis and drug resistance to chemotherapy. From a histological point of view, the tumor is supported by a rich tumor microenvironment (TME) consisting of a dense and fibrous stroma, known as desmoplastic, and a highly specialized extracellular matrix (ECM) composed of collagens, fibronectin, hyaluronic acid, proteoglycans, laminin, elastin, and metalloproteinases. This gives the ECM a rigid and poorly vascularized structure that hinders drug penetration and the function of immune cells. Additionally, in the ECM, the accumulation of growth factors maintains a TME that facilitates the survival and progression of malignant cells. There are several models for PDAC investigations: i) organoids, even derived from patient tumor cells, ii) tumor chips, which integrate 3D tumor cells with microfluidic systems, and iii) spheroids, which are the most widely used. While well established, these models do not completely reproduce the complexity of the in vivo microenvironment, such as the presence of ECM and the desmoplastic stromal tissue. Moreover, the type of cells, culture conditions, and operator technique result in poor reproducibility of the model, which is, however, widely used in the screening of new compounds. On the other hand, literature reports a high failure rate of drugs in transitioning from the experimental to the clinical phase, often due to the poor predictability of preclinical study models. This thesis aims to develop a biomimetic and more standardized 3D model of PDAC through bioprinting technology based on additive manufacturing. We have defined this model as Bioprinted PDAC Avatar (BPA). The combination of CAFs cells from the patient/Bxpc3 and hydrogel allows the creation of bioink that, extruded following a CAD design, generates a 3D model with specific geometric characteristics. This technology is synonymous with standardization and reproducibility. The models were obtained using bioink consisting of a specific hydrogel mixed with CAFs cells isolated from 3 different patients and tumor cells. The models were cultured for 4 weeks and characterized by histological and molecular biology techniques at three different time points. The results showed that BPA recapitulates the complexity of the tumoral tissue and physiological architecture of the disease, confirming its biomimicry. Histological investigations confirmed the expression of PDAC: CK9/19, and pankeratin; increased gene expression of KI67 and caspases; and an increase in fibronectin, metalloproteinases, and interleukin levels in the culture supernatant, indicating ECM remodeling, typical of the disease in vivo. Gemcitabine and Nab-Paclitaxel were then administered at different concentrations to both BPA and spheroids, as controls for comparison. Viability assays showed that both models could be targeted by known anti-PDAC agents. The high level of biomimicry allows for simulation of the predictability related to the diffusion of compounds into the matrix, an aspect absent in other 3D models, and the detail of the involved pathways. Collectively, our findings suggest that BPA may be a promising standardized platform for anti-tumor drug testing thanks to a more realistic biomimicking related to better interactions between tumor, stroma and ECM, as hallmarks of PDAC

L'adenocarcinoma duttale del pancreas (PDAC) è una patologia caratterizzata da una prognosi estremamente sfavorevole a causa dell’elevato rischio di metastasi e della resistenza ai farmaci chemioterapici. Dal punto di vista istologico, il tumore è supportato da un ricco microambiente tumorale (TME) costituito da uno stroma denso e fibroso, noto come desmoplastico, e da una matrice extracellulare (ECM) altamente specializzata composta da collagene, fibronectina, acido ialuronico, proteoglicani, laminina, elastina e metalloproteinasi. Questo conferisce alla ECM una struttura rigida e scarsamente vascolarizzata che ostacola la penetrazione dei farmaci e la funzione delle cellule immunitarie. Inoltre, all'interno della ECM, l'accumulo di fattori di crescita mantiene un TME che favorisce la sopravvivenza e la progressione delle cellule tumorali maligne. Esistono diversi modelli per lo studio del PDAC: i) organoidi, anche derivati da cellule tumorali di pazienti, ii) tumor chip, che integrano cellule tumorali 3D con sistemi microfluidici, e iii) sferoidi, che sono i più ampiamente utilizzati. Sebbene consolidati, questi modelli non riproducono completamente la complessità del microambiente in vivo, come la presenza della ECM e del tessuto stromale desmoplastico. Inoltre, la tipologia cellulare, le condizioni di coltura e la manualità dell'operatore comportano una scarsa riproducibilità del modello, che è comunque ampiamente impiegato nello screening di nuovi composti. D'altra parte, la letteratura riporta un elevato tasso di fallimento dei farmaci nel passaggio dalla fase sperimentale a quella clinica, spesso dovuto alla scarsa predittività dei modelli preclinici. Questa tesi si propone di sviluppare un modello 3D biomimetico e standardizzato di PDAC mediante tecnologia di bioprinting. Abbiamo definito questo modello come Bioprinted PDAC Avatar (BPA). La combinazione di CAFs derivate da pazienti/cellule BxPC-3 e hydrogel consente la creazione di un bioink che, estruso secondo un design CAD, genera un modello 3D con caratteristiche geometriche specifiche. Questa tecnologia è sinonimo di standardizzazione e riproducibilità. I modelli sono stati realizzati utilizzando bioink costituito da uno specifico hydrogel miscelato con cellule CAFs isolate da 3 diversi pazienti e cellule tumorali. I modelli sono stati coltivati per 4 settimane e caratterizzati mediante tecniche istologiche e di biologia molecolare in tre diversi time point. I risultati hanno mostrato che il BPA ricapitola la complessità del tessuto tumorale e l’architettura fisiologica della malattia, confermando la sua biomimicità. Le analisi istologiche hanno confermato l’espressione di marker tipici del PDAC: CK9/19 e pancheratina; è stato osservato un aumento dell'espressione genica di KI67 e delle caspasi; inoltre, si è registrato un incremento dei livelli di fibronectina, metalloproteinasi e interleuchine nel surnatante di coltura, indicando il rimodellamento della ECM, tipico della malattia in vivo. Successivamente, Gemcitabina e Nab-Paclitaxel sono stati somministrati a diverse concentrazioni sia al BPA sia agli sferoidi, utilizzati come controllo comparativo. I saggi di vitalità cellulare hanno mostrato che entrambi i modelli rispondono ai farmaci anti-PDAC noti. L’elevato grado di biomimicità consente di simulare la predittività legata alla diffusione dei composti nella matrice, un aspetto assente negli altri modelli 3D, oltre a permettere un'analisi più dettagliata dei pathway coinvolti. Complessivamente, i nostri risultati suggeriscono che il BPA potrebbe rappresentare una promettente piattaforma standardizzata per il test di farmaci antitumorali, grazie a una biomimicità più realistica che migliora le interazioni tra tumore, stroma ed ECM, caratteristiche distintive del PDAC.

Tumore pancreatico bio-stampato: un nuovo modello di avatar tissutale per lo studio della biomimesi tumorale e lo screening farmacologico

BERGAMINI, VALENTINA
2025

Abstract

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a disease with a highly poor prognosis due to the high risk of metastasis and drug resistance to chemotherapy. From a histological point of view, the tumor is supported by a rich tumor microenvironment (TME) consisting of a dense and fibrous stroma, known as desmoplastic, and a highly specialized extracellular matrix (ECM) composed of collagens, fibronectin, hyaluronic acid, proteoglycans, laminin, elastin, and metalloproteinases. This gives the ECM a rigid and poorly vascularized structure that hinders drug penetration and the function of immune cells. Additionally, in the ECM, the accumulation of growth factors maintains a TME that facilitates the survival and progression of malignant cells. There are several models for PDAC investigations: i) organoids, even derived from patient tumor cells, ii) tumor chips, which integrate 3D tumor cells with microfluidic systems, and iii) spheroids, which are the most widely used. While well established, these models do not completely reproduce the complexity of the in vivo microenvironment, such as the presence of ECM and the desmoplastic stromal tissue. Moreover, the type of cells, culture conditions, and operator technique result in poor reproducibility of the model, which is, however, widely used in the screening of new compounds. On the other hand, literature reports a high failure rate of drugs in transitioning from the experimental to the clinical phase, often due to the poor predictability of preclinical study models. This thesis aims to develop a biomimetic and more standardized 3D model of PDAC through bioprinting technology based on additive manufacturing. We have defined this model as Bioprinted PDAC Avatar (BPA). The combination of CAFs cells from the patient/Bxpc3 and hydrogel allows the creation of bioink that, extruded following a CAD design, generates a 3D model with specific geometric characteristics. This technology is synonymous with standardization and reproducibility. The models were obtained using bioink consisting of a specific hydrogel mixed with CAFs cells isolated from 3 different patients and tumor cells. The models were cultured for 4 weeks and characterized by histological and molecular biology techniques at three different time points. The results showed that BPA recapitulates the complexity of the tumoral tissue and physiological architecture of the disease, confirming its biomimicry. Histological investigations confirmed the expression of PDAC: CK9/19, and pankeratin; increased gene expression of KI67 and caspases; and an increase in fibronectin, metalloproteinases, and interleukin levels in the culture supernatant, indicating ECM remodeling, typical of the disease in vivo. Gemcitabine and Nab-Paclitaxel were then administered at different concentrations to both BPA and spheroids, as controls for comparison. Viability assays showed that both models could be targeted by known anti-PDAC agents. The high level of biomimicry allows for simulation of the predictability related to the diffusion of compounds into the matrix, an aspect absent in other 3D models, and the detail of the involved pathways. Collectively, our findings suggest that BPA may be a promising standardized platform for anti-tumor drug testing thanks to a more realistic biomimicking related to better interactions between tumor, stroma and ECM, as hallmarks of PDAC
9-lug-2025
Inglese
L'adenocarcinoma duttale del pancreas (PDAC) è una patologia caratterizzata da una prognosi estremamente sfavorevole a causa dell’elevato rischio di metastasi e della resistenza ai farmaci chemioterapici. Dal punto di vista istologico, il tumore è supportato da un ricco microambiente tumorale (TME) costituito da uno stroma denso e fibroso, noto come desmoplastico, e da una matrice extracellulare (ECM) altamente specializzata composta da collagene, fibronectina, acido ialuronico, proteoglicani, laminina, elastina e metalloproteinasi. Questo conferisce alla ECM una struttura rigida e scarsamente vascolarizzata che ostacola la penetrazione dei farmaci e la funzione delle cellule immunitarie. Inoltre, all'interno della ECM, l'accumulo di fattori di crescita mantiene un TME che favorisce la sopravvivenza e la progressione delle cellule tumorali maligne. Esistono diversi modelli per lo studio del PDAC: i) organoidi, anche derivati da cellule tumorali di pazienti, ii) tumor chip, che integrano cellule tumorali 3D con sistemi microfluidici, e iii) sferoidi, che sono i più ampiamente utilizzati. Sebbene consolidati, questi modelli non riproducono completamente la complessità del microambiente in vivo, come la presenza della ECM e del tessuto stromale desmoplastico. Inoltre, la tipologia cellulare, le condizioni di coltura e la manualità dell'operatore comportano una scarsa riproducibilità del modello, che è comunque ampiamente impiegato nello screening di nuovi composti. D'altra parte, la letteratura riporta un elevato tasso di fallimento dei farmaci nel passaggio dalla fase sperimentale a quella clinica, spesso dovuto alla scarsa predittività dei modelli preclinici. Questa tesi si propone di sviluppare un modello 3D biomimetico e standardizzato di PDAC mediante tecnologia di bioprinting. Abbiamo definito questo modello come Bioprinted PDAC Avatar (BPA). La combinazione di CAFs derivate da pazienti/cellule BxPC-3 e hydrogel consente la creazione di un bioink che, estruso secondo un design CAD, genera un modello 3D con caratteristiche geometriche specifiche. Questa tecnologia è sinonimo di standardizzazione e riproducibilità. I modelli sono stati realizzati utilizzando bioink costituito da uno specifico hydrogel miscelato con cellule CAFs isolate da 3 diversi pazienti e cellule tumorali. I modelli sono stati coltivati per 4 settimane e caratterizzati mediante tecniche istologiche e di biologia molecolare in tre diversi time point. I risultati hanno mostrato che il BPA ricapitola la complessità del tessuto tumorale e l’architettura fisiologica della malattia, confermando la sua biomimicità. Le analisi istologiche hanno confermato l’espressione di marker tipici del PDAC: CK9/19 e pancheratina; è stato osservato un aumento dell'espressione genica di KI67 e delle caspasi; inoltre, si è registrato un incremento dei livelli di fibronectina, metalloproteinasi e interleuchine nel surnatante di coltura, indicando il rimodellamento della ECM, tipico della malattia in vivo. Successivamente, Gemcitabina e Nab-Paclitaxel sono stati somministrati a diverse concentrazioni sia al BPA sia agli sferoidi, utilizzati come controllo comparativo. I saggi di vitalità cellulare hanno mostrato che entrambi i modelli rispondono ai farmaci anti-PDAC noti. L’elevato grado di biomimicità consente di simulare la predittività legata alla diffusione dei composti nella matrice, un aspetto assente negli altri modelli 3D, oltre a permettere un'analisi più dettagliata dei pathway coinvolti. Complessivamente, i nostri risultati suggeriscono che il BPA potrebbe rappresentare una promettente piattaforma standardizzata per il test di farmaci antitumorali, grazie a una biomimicità più realistica che migliora le interazioni tra tumore, stroma ed ECM, caratteristiche distintive del PDAC.
PDAC; bio-stampaggio; test per farmaci; test in vitro; Modello 3D
DOMINICI, Massimo
VINCETI, Marco
Università degli studi di Modena e Reggio Emilia
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14242/215228
Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIMORE-215228