Caratterizzazione molecolare dell'integrasi di HIV-1 in pazienti camerunesi infettati da sottotipi non-B = Molecular characterization of HIV-1 integrase among non-subtype B infected Cameroonian patients

Sub-Saharan Africa (SSA) alone carries 70% of the global HIV epidemics and about one third of people living with HIV harbours drug resistant viruses in this geographical setting. Moreover, SSA has a wide genetic diversity of HIV (including both HIV types 1 and 2), with an important predominance of HIV-1 non-subtype B viruses that might have a clinical significance in terms of viral pathogenesis and treatment response. This is particularly true for West and Central Africa where several clades have been described, with anecdotal clinical implications. Due to increasing trends of efavirenz/nevirapine pretreatment drug resistance (above 10%) in several SSA countries, WHO recommends transitioning from the first generation non-nucleoside reverse-transcriptase inhibitor (NNRTI)-based regimen to dolutegravir-based regimen as preferred initial antiretroviral therapy (ART), and as a possible alternative in managing cases of multi-resistance. The aim of this thesis was to evaluate the level of integrase resistance associated mutations according to viral diversity in the integrase coding region of HIV-1 among Cameroonian patients infected with non-B subtype viruses. Specifically, we sought to i) develop and validate a genotyping tool to survey the emergence of integrase strand transfer inhibitors (INSTI) drug resistance mutations (DRMs) among Cameroonian patients infected with non-B subtype viruses; ii) determine the patterns of INSTI-resistance among INSTI-naïve patients; iii) determine the patterns of INSTI-resistance among INSTI-experienced patients. Firstly, we developed and validated an in-house HIV-1 integrase-genotyping assay which yielded high performances (82.81% and 85.00% respectively at viremia >1000 copies/mL and ≥100,000 copies/mL) despite the high genetic diversity of HIV found (18 different clades). The high effectiveness on both pure and recombinant viral clades even at low-level viremia (73.68% at 500-999 copies/mL), underscores the usefulness of this accessible and easily reproducible genotyping assay in monitoring the emergence of INSTI-DRMs in SSA and beyond. Secondly, among 918 INSTI-naïve Cameroonian patients (89 ART-naïve versus 829 ARTexperienced; all-encompassing 37 HIV clades) we found a prevalence of 0.8% [95%CI: 0.4– 1.7] INSTI-DRMs, with 0.0% [95%CI: 0.0–4.0] amongst ART–naïve versus 0.9% [95%CI: 0.5–1.9] amongst ART-experienced; p=0.44. This baseline data suggests the effectiveness of INSTI- and especially dolutegravir-containing regimens within the Cameroonian ART program. Additionally, out of 288 HIV-1 integrase amino acid positions, 58.3% were highly conserved across subtypes in the following major regions: V75-G82, E85-P90, H114-G118, K127-W132, E138-G149, Q168-L172, T174-V180, W235-A239, and L241-D253, which serve as hallmark for the surveillance of potential novel INSTI-DRMs. Transitioning to this new ART-paradigm, in a context of diverse viral strains and high HIV integraseconservation, will therefore require the monitoring of the dynamics in the selection of INSTI-DRMs for possible update and considerations in future treatment strategies. Thirdly, a systematic review revealed an increasing use of dolutegravir overtime (0% before 2018 to 100% in 2021), with 88.51% [95%CI: 73.83–97.80] of virological control (viremia Major integrase-mutations observed in this patient’s reservoirs were G140R and G163R; whereas only accessory mutations (L74I, T97A and E157Q) were found among raltegravir-unexposed patients. This is worth noting as we found in another setting a 65 years old Cameroonian (infected with an HIV-1, CRF18_cpx virus), previously exposed to raltegravir, and failing on third-line treatment with multidrug resistance to darunavir/r and dolutegravir. Thus, while adopting dolutegravir-containing-regimen as a preferred 3L public health approach in the Cameroonian ART program, there should be caution when dealing with patients with prior exposure to raltegravir due to risks of archived/selected INSTI-DRMs. In conclusion, overall findings in this thesis revealed the high performance of HIV-1 integrase genotyping assay on diverse viral clades, indicating assay utility and reproducibility at global level; a high genetic conservation of HIV-1 integrase regions across circulating clades pave the way for a hallmark toward an optimal surveillance of INSTI-DRMs in our settings; the high effectiveness of INSTI-containing regimens in SSA and specifically dolutegravir superiority effect in achieving virological control compared to other INSTIs, provides assurance for promising outcomes in ART programs in RLS; the presence of up to 37 HIV clades confirms the wide diversity of HIV-1 in the Cameroonian context. Nonetheless, detection of some preliminary cases of INSTI-DRMs, especially a case of multi-drug resistant including INSTI, calls for caution in using dolutegravircontaining ART regimens in order to preserves its effectiveness on the long run, with a focus on patients under third-line ART with prior exposure to raltegravir

L'Africa subsahariana (SSA) da sola ospita il 70% dell'epidemia globale di HIV e circa un terzo delle persone affette da HIV presenta virus resistenti ai farmaci in questo contesto geografico. Inoltre, la SSA presenta un'ampia diversità genetica dell'HIV (compresi entrambi i tipi 1 e 2), con un'importante predominanza di virus HIV-1 sottotipo non-B che potrebbe avere un significato clinico in termini di patogenesi virale e risposta al trattamento. Ciò è particolarmente vero per l'Africa occidentale e centrale, dove sono stati descritti diversi cladi, con implicazioni cliniche aneddotiche. A causa delle crescenti tendenze di resistenza ai farmaci efavirenz/nevirapina prima del trattamento (superiori al 10%) in diversi Paesi dell'SSA, l'OMS raccomanda di passare da un regime a base di inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTI) di prima generazione a un regime a base di dolutegravir come terapia antiretrovirale (ART) iniziale preferita e come possibile alternativa nella gestione dei casi di multiresistenza. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare il livello di mutazioni associate alla resistenza agli inibitori dell'integrasi in base alla diversità virale nella regione codificante dell'integrasi dell'HIV1 tra i pazienti camerunesi infettati con virus di sottotipo non-B. In particolare, abbiamo cercato di i) sviluppare e validare uno strumento di genotipizzazione per rilevare l'emergere di mutazioni di resistenza ai farmaci inibitori del trasferimento del filamento dell'integrasi (INSTI) tra i pazienti camerunesi infettati con virus sottotipo non-B; ii) determinare i modelli di resistenza agli INSTI tra i pazienti INSTI-naïve; iii) determinare i modelli di resistenza agli INSTI tra i pazienti INSTI-experienced. In primo luogo, abbiamo sviluppato e validato un saggio di genotipizzazione dell'integrasi di HIV-1 che ha fornito prestazioni elevate (82,81% e 85,00% rispettivamente per viremie >1000 copie/mL e ≥100.000 copie/mL) nonostante l'elevata diversità genetica dell'HIV riscontrata (18 cladi diversi). L'elevata efficacia sui numeorsi e vari cladi virali, puri e ricombinanti, anche a bassi livelli di viremia (73,68% a 500-999 copie/mL), sottolinea l'utilità di questo saggio di genotipizzazione accessibile e facilmente riproducibile per monitorare l'emergere di INSTI-DRM in SSA e oltre. In secondo luogo, tra 918 pazienti camerunesi INSTI-naïve (89 ART-naïve e 829 con esperienza di ART; tutti comprendenti 37 cladi di HIV) abbiamo riscontrato una prevalenza dello 0,8% [95%CI: 0,4-1,7] di INSTI-DRM, con lo 0,0% [95%CI: 0,0-4,0] tra gli ART-naïve contro lo 0,9% [95%CI: 0,5-1,9] tra gli ART-experienced; p=0,44. Questi dati di base suggeriscono l'efficacia dei regimi contenenti INSTI e soprattutto dolutegravir all'interno del programma ART camerunese. Inoltre, su 288 posizioni aminoacidiche dell'integrasi dell'HIV-1, il 58,3% era altamente conservato tra i sottotipi nelle seguenti regioni principali: V75-G82, E85-P90, H114-G118, K127-W132, E138-G149, Q168-L172, T174-V180, W235-A239 e L241-D253, che fungono da segno distintivo per la sorveglianza di potenziali nuovi INSTI-DRM. La transizione a questo nuovo paradigma ART, in un contesto di ceppi virali diversi e di elevata conservazione dell'integrasi dell'HIV, richiederà quindi il monitoraggio delle dinamiche nella selezione degli INSTI-DRM per eventuali aggiornamenti e considerazioni sulle future strategie terapeutiche. In terzo luogo, una revisione sistematica ha rivelato un uso crescente di dolutegravir nel tempo (dallo 0% prima del 2018 al 100% nel 2021), con l'88,51% [95%CI: 73,83-97,80] di controllo virologico (viremia 50 copie/mL) con dolutegravir rispetto all'82,49% [95%CI: 55,76-99,45] e al 96,55% [95%CI: 85,7-100,00] con raltegravir ed elvitegravir, rispettivamente in SSA. Inoltre, il controllo virologico con regimi contenenti dolutegravir rispetto ad altri INSTI è risultato significativamente più elevato (OR=1,44 [95%CI: 1,15- 1,79], p=0,0014), suggerendo un effetto di superiorità di dolutegravir rispetto ad altri xv INSTI in SSA. Inoltre, le principali INSTI-DRM riportate comprendevano T66A, T66I, T66V, G118R, E138A, E138K, E138Q, G140A, G140S, Y143C, Y143H, Y143R, Y143S, S147G, Q148R, Q148K, N155H, N155D, G163R e R263K, mentre le mutazioni accessorie riguardano L74I, Q95K, T97A, V151I e E157Q. Pertanto, anche se con tassi apparentemente bassi al momento, questo rilevamento di INSTI-DRM richiede una sorveglianza sentinella e basata sulla popolazione per una transizione di successo e un'efficacia sostenuta di dolutagravir in tutti i Paesi dell'SSA. In quarto luogo, nella nostra pratica di routine, non abbiamo riscontrato alcuna DRM maggiore da INSTI tra 348 pazienti con esperienza di INSTI (310 che iniziavano la prima linea di ART contenente dolutegravir e 38 che passavano alla terza linea di ART contenente dolutegravir con precedenti DRM a tutte le altre classi di farmaci). È interessante notare che il 94,83% (330/348) aveva una viremia soppressa (1000 copie/ml). In particolare, abbiamo riscontrato il 96,45% (299/310) di soppressione virale dopo una durata mediana [IQR] della ART in prima linea di 14 [12-17] mesi e l'81,58% (31/38) di soppressione virale dopo circa 21 [17-32] mesi in terza linea, indipendentemente dal profilo genotipico al momento dell'arruolamento, dalle variazioni nei terza linea regimi (p=0,87) e dalla conta dei CD4 al basale (p=0,34). Questi risultati supportano l'attuale transizione verso regimi contenenti dolutegravir, come raccomandato dall'OMS per la ART di prima linea e come alternativa adeguata in caso di resistenza multifarmaco in contesti con risorse limitate come il Camerun. Tuttavia, i pochi casi di fallimento della terza linea riportati (circa 1/10) invitano a una stretta sorveglianza di questi pazienti come ultima opzione terapeutica nella nostra strategia ART locale e ad accedere a nuovi farmaci innovativi completamente attivi nell'armamentario ARV. Infine, tra i 53 pazienti sottoposti a ART di terza linea a base di INSTI, abbiamo trovato 1/14 (7,14%) INSTI-DRM archiviati (un paziente precedentemente esposto a raltegravir, con viremia plasmatica 40 copie/ml). Le principali mutazioni dell'integrasi osservate nei reservoir di questo paziente sono state G140R e G163R, mentre in pazienti non esposti a raltegravir sono state trovate solo mutazioni accessorie (L74I, T97A e E157Q). Questo dato è degno di nota, poiché in un altro contesto abbiamo riscontrato un camerunense di 65 anni (infettato da un virus HIV-1, CRF18_cpx), precedentemente esposto a raltegravir, e in fallimento nel trattamento di terza linea con resistenza multifarmaco a darunavir/r e dolutegravir. Pertanto, pur adottando un regime contenente dolutegravir come approccio preferenziale di salute pubblica 3L nel programma ART camerunese, occorre prestare cautela quando si tratta di pazienti con precedente esposizione a raltegravir a causa dei rischi di INSTI-DRM archiviati/selezionati. In conclusione, i risultati di questa tesi hanno rivelato le elevate prestazioni del saggio di genotipizzazione dell'integrasi dell'HIV-1 su diversi cladi virali, indicando l'utilità e la riproducibilità del saggio a livello globale; l'elevata conservazione genetica delle regioni dell'integrasi dell'HIV-1 tra i cladi circolanti apre la strada a un segno distintivo verso una sorveglianza ottimale degli INSTI-DRM nei nostri ambienti; l'elevata efficacia dei regimi contenenti INSTI nell'SSA e, in particolare, l'effetto di superiorità di dolutegravir nel raggiungere il controllo virologico rispetto ad altri INSTI, forniscono risultati promettenti nei programmi ART in RLS; la presenza di fino a 37 cladi di HIV conferma l'ampia diversità di HIV-1 nel contesto camerunese. Tuttavia, il rilevamento di alcuni casi preliminari di INSTI-DRM, in particolare di un caso di multiresistenza ai farmaci inclusi gli INSTI, richiede cautela nell'uso di regimi ART contenenti dolutegravir al fine di preservarne l'efficacia a lungo termine, con particolare attenzione ai pazienti in terza linea di ART con precedente esposizione a raltegravir.