MODELLI DI BIORAFFINERIA SOSTENIBILE A PARTIRE DAGLI SCARTI CASEARI: VALORIZZAZIONE A CASCATA DEL PERMEATO DI SIERO DI LATTE IN BIOETANOLO E BIOENERGIA MEDIANTE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE

Cheese whey permeate (CWP) is a lactose-rich effluent by-product of the dairy industry and poses significant environmental and economic challenges due to its high organic content and disposal costs. This Innovative PhD project with Industrial characterization aimed to develop a sustainable biorefinery concept to valorise CWP by integrating bioethanol and biomethane production through a cascade biomass valorisation approach. This was led in collaboration with Distilleria Bartin S.r.l (San Basilio, Mottola, Taranto) an Apulian biorefinery plant that besides the distillery activities is involved in the agri-industrial waste management producing biomethane and bioenergy. In the first phase, the physiological traits of the non-conventional yeast K. marxianus, were characterized under industrially relevant conditions, focusing on their ability to ferment CWP into ethanol at high temperatures and high lactose concentrations. K. marxianus strains DSM 5422, DSM 7239, and DSM 5572, were characterized by comparing their performance to the industrial reference strain CBS 397. The experiments highlighted significant variability in β-galactosidase activity, growth kinetics, ethanol yields, and stress tolerance, laying the foundation for strain selection and optimization. The second phase, conducted in collaboration and at University College Cork, Yeast Research Lab led by Prof. John P. Morrissey, employed metabolic engineering strategies to improve strain performance under challenging industrial conditions. CRISPR-Cas9 technology was used to modify stress-related pathways, targeting genes involved in membrane integrity and metabolic regulation. The overexpression of transcription factors such as UPC2, MSN2 and RRI1 in the engineered strains resulted in improved tolerance to thermal and acid stresses. Flow cytometry and HPLC analyses were used to assess membrane robustness and substrate utilization, confirming the value of the genetic modifications. In the third phase, conducted at Distilleria Bartin, the fermentation residue from ethanol production was subjected to anaerobic digestion (AD) test to evaluate whether was viable to produce biomethane from this never-characterised before side stream, closing the loop of resource recovery. The AD process at lab-scale demonstrated efficient conversion of fermentation residues to biomethane suggesting the compatibility with industrial applications of this process. The integrated results demonstrated that the cascade valorisation approach is technically and economically viable, transforming CWP from a waste product into valuable biofuels. The combination of CWP to ethanol fermentation with anaerobic digestion offers a robust framework for sustainable bioprocesses, aligning with the principles of the circular bioeconomy. Moreover, the industrial applicability of the proposed biorefinery concept highlights its potential to reduce the environmental footprint of dairy byproducts while generating bioenergy and economic value. This research underscores the importance of leveraging biotechnological advancements to address local challenges in waste management and renewable energy production. The cascade valorisation strategy presented in this thesis could serve as a scalable model for other agro-industrial byproducts, paving the way for the adoption of these sustainable biorefinery systems by Distilleria Bartin.

Il permeato di siero di latte è un sottoprodotto dell'industria lattiero-casearia ricco di lattosio e pone notevoli sfide ambientali ed economiche a causa del suo alto contenuto organico e dei costi di smaltimento. Questo progetto di dottorato innovativo con caratterizzazione industriale ha mirato a sviluppare un concetto sostenibile di bioraffineria per valorizzare il permeato di siero di latte integrando la produzione di bioetanolo e di biometano attraverso un approccio di valorizzazione della biomassa a cascata. Questo è stato condotto in collaborazione con la Distilleria Bartin S.r.l (San Basilio, Mottola, Taranto) un impianto di bioraffineria pugliese che oltre alle attività di distilleria è coinvolta nella gestione dei rifiuti agroindustriali producendo biometano e bioenergia. Nella prima fase, i tratti fisiologici del lievito non convenzionale K. marxianus sono stati caratterizzati in condizioni di rilevanza industriale, concentrandosi sulla loro capacità di fermentazione del lattosio del permeato di siero di latte in etanolo ad alte temperature e ad elevate concentrazioni di lattosio. I ceppi di K. marxianus DSM 5422, DSM 7239 e DSM 5572 sono stati caratterizzati confrontando le loro prestazioni con il ceppo di riferimento industriale K. marxianus CBS 397. Gli esperimenti hanno evidenziato una variabilità significativa nel l'attività β-galattosidasi, nella cinetica di crescita, nelle rese di etanolo e nella tolleranza agli stress, ponendo le basi per la selezione e l'ottimizzazione dei ceppi. La seconda fase, condotta in collaborazione con il laboratorio di ricerca sui lieviti del l'University College Cork, guidato dal prof. John P. Morrissey, ha impiegato strategie di ingegneria metabolica per migliorare le prestazioni dei ceppi in condizioni industriali. La tecnologia CRISPR-Cas9 è stata utilizzata per modificare le vie correlate allo stress di membrana, prendendo come target i geni coinvolti nell'integrità della membrana e nella regolazione metabolica della stessa. L’over-espressione dei geni fattori di trascrizione quali UPC2, MSN2 e RRI1 nei ceppi ingegnerizzati ha portato a una migliore tolleranza agli stress termici e acidi. La citometria a flusso e l'analisi HPLC sono state utilizzate per valutare la robustezza della membrana e l'utilizzo del substrato, confermando il valore delle modifiche genetiche nei ceppi di lievito. Nella terza fase, condotta presso i laboratori di Distilleria Bartin, il residuo di fermentazione dalla produzione di etanolo è stato sottoposto a prove di digestione anaerobica per valutare se fosse possibile produrre biometano da questo scarto di processo mai caratterizzato prima. Il processo di digestione anaerobica in laboratorio ha dimostrato l'efficienza della conversione dei residui di fermentazione in biometano, suggerendo la compatibilità con le applicazioni industriali di questo processo. I risultati integrati hanno dimostrato che l'approccio di valorizzazione a cascata è tecnicamente ed economicamente fattibile, trasformando il permeato di siero di latte da prodotto di scarto in preziosi biocarburanti. La combinazione della fermentazione alcolica e la digestione anaerobica del permeato di siero di latte offre un quadro solido per bioprocessi sostenibili, allineati ai principi della bioeconomia circolare. Inoltre, l'applicabilità industriale del concetto di bioraffineria proposto evidenzia il suo potenziale per ridurre l'impronta ambientale dei sottoprodotti lattiero-caseari generando bioenergia e valore economico. Questa ricerca sottolinea l'importanza di sfruttare i progressi biotecnologici per affrontare le sfide locali nella gestione dei rifiuti e nella produzione di energia rinnovabile. La strategia di valorizzazione a cascata presentata in questa tesi potrebbe servire come modello scalabile per altri sottoprodotti agroindustriali, aprendo la strada all'adozione di questi sistemi sostenibili di bioraffineria da parte della Distilleria Bartin.