Non-conventional yeast-based platform to obtain value-added bioproducts

Yarrowia lipolytica is an oleaginous, unconventional yeast with significant potential as a biotechnologically relevant microbial factory. It is versatile and efficient in utilizing various substrates, from carbohydrates like glucose and glycerol to hydrophobic substrates such as fatty acids, oils, and volatile short-chain fatty acids. This yeast naturally produces a wide range of products, including organic acids, sugars, lipids, and enzymes, making it a suitable host for heterologous production through recent molecular tools for genetic manipulation. The first chapter explores the use of Waste Cooking Oils (WCOs) as a feedstock for producing Single Cell Oils (SCOs) and lipases using wild-type Y. lipolytica. The study demonstrates the yeast ability to utilize high concentrations of WCOs to produce intracellular lipids and extracellular lipases, with lipase activity assessed by spectrophotometric methods and intracellular lipids analysed using flow cytometry. Various minimal media and pH conditions were tested, revealing a correlation between reduced free fatty acids in the culture medium and increased SCO and lipase activity. The second chapter focuses on producing isocitric acid (ICA) through genetic engineering and bioprocess improvement strategies. Genetic modifications involved deleting the citrate mitochondrial carrier Ylyhm2 and overexpressing the citrate mitochondrial carrier YlSfc1 and the citrate membrane export Cex1 genes, significantly increasing ICA production. Overexpression of YlOAC1, encoding for oxaloacetate mitochondrial carrier, improved carbon flux towards the tricarboxylic acid cycle, further enhancing ICA production efficiency. The optimized process achieved a record ICA production of 152.7 g/L with a selectivity of 92%. The third chapter examines itaconic acid (IA) production using biosynthetic pathways from Aspergillus terreus and Ustilago maydis in Y. lipolytica, combined with deletion of Ylyhm2 and Cex1 genes, resulting in high IA production on glucose (55.08 g/L) and glycerol (37.71 g/L), emphasizing the importance of regulating metabolite fluxes and using simple cultivation conditions. The fourth chapter focuses on converting acetate into itaconic acid (IA) using genetically engineered Y. lipolytica. Optimizing amino acid supplementation, pH levels, and inoculum size enhanced IA production. The scale-up process in a 5-L bioreactor using a batch and fed-batch strategy demonstrated feasibility, achieving a final IA titre of 3.0 g/L and 13.7 g/L of biomass. Despite lower yields compared to bacterial studies, Y. lipolytica shows promise for IA production from acetate.

Yarrowia lipolytica è un lievito oleaginoso e non convenzionale con un significativo potenziale come fabbrica microbica biotecnologicamente rilevante. È versatile ed efficiente nell'utilizzare vari substrati, dai carboidrati come glucosio e glicerolo ai substrati idrofobici come acidi grassi, oli e acidi grassi volatili a catena corta. Questo lievito produce naturalmente una vasta gamma di prodotti, tra cui acidi organici, zuccheri, lipidi ed enzimi, rendendolo un ospite adatto per la produzione eterologa grazie agli strumenti molecolari recenti per la manipolazione genetica. Il primo capitolo esplora l'uso degli oli di cottura esausti (WCO) come materia prima per la produzione di oli cellulari (SCO) e lipasi usando il ceppo selvatico di Y. lipolytica. Lo studio dimostra la capacità del lievito di utilizzare alte concentrazioni di WCO per produrre lipidi intracellulari e lipasi extracellulari, con l'attività delle lipasi valutata mediante metodi spettrofotometrici e l'analisi dei lipidi intracellulari effettuata con citometria a flusso. Sono stati testati diversi mezzi minimali e condizioni di pH, rivelando una correlazione tra la riduzione degli acidi grassi liberi nel mezzo di coltura e l'aumento di SCO e dell'attività delle lipasi. Il secondo capitolo si concentra sulla produzione di acido isocitrico (ICA) attraverso strategie di ingegneria genetica e miglioramento dei bioprocessi. Le modifiche genetiche hanno comportato la cancellazione del trasportatore mitocondriale del citrato Ylyhm2 e la sovraespressione dei geni YlSfc1 e Cex1, incrementando significativamente la produzione di ICA. La sovraespressione di YlOAC1, che codifica per il trasportatore mitocondriale dell'ossalacetato, ha migliorato il flusso di carbonio verso il ciclo dell'acido tricarbossilico, aumentando ulteriormente l'efficienza della produzione di ICA. Il processo ottimizzato ha raggiunto una produzione record di ICA di 152,7 g/L con una selettività del 92%. Il terzo capitolo esamina la produzione di acido itaconico (IA) utilizzando le vie biosintetiche di Aspergillus terreus e Ustilago maydis in Y. lipolytica, combinata con la cancellazione dei geni Ylyhm2 e Cex1, ottenendo una produzione elevata di IA su glucosio (55,08 g/L) e glicerolo (37,71 g/L), enfatizzando l'importanza della regolazione dei flussi metabolici e dell'uso di condizioni di coltivazione semplici. Il quarto capitolo si concentra sulla conversione dell'acetato in acido itaconico (IA) utilizzando un ceppo geneticamente ingegnerizzato di Y. lipolytica. L'ottimizzazione della supplementazione di amminoacidi, dei livelli di pH e delle dimensioni dell'inoculo ha migliorato la produzione di IA. Il processo di scala in un bioreattore da 5 litri utilizzando una strategia batch e fed-batch ha dimostrato la fattibilità, raggiungendo una produzione finale di IA di 3,0 g/L e 13,7 g/L di biomassa. Nonostante rese inferiori rispetto agli studi batterici precedenti, Y. lipolytica mostra promesse per la produzione di IA da acetato. Questi studi evidenziano la robustezza e la versatilità di Y. lipolytica come fabbrica microbica per la produzione sostenibile di composti ad alto valore come ICA e IA, enfatizzando l'importanza dell'ingegneria genetica e dei bioprocessi ottimizzati per applicazioni industriali.