AQP3 e AQP9 leucocitarie nella sepsi umana: approcci cellulari e di Machine Learning nello studio della loro rilevanza prognostica e patofisiologica

Sepsis is a multifaceted pathology defined as a severe, potentially fatal, organic dysfunction caused by an inadequate or dysregulated host response to infection. The in-hospital mortality rate related to sepsis remains above 10%, while in cases of septic shock, its most severe complication characterized by multiple organ failure, it exceeds 40%. Aquaporins (AQPs) are a family of membrane channel proteins that facilitate the transport of water and small neutral solutes across biological membranes, crucial for maintaining cellular homeostasis. In mammals, 13 AQPs (AQP0–AQP12) have been identified and are subdivided upon phylogenetic and functional characteristics: orthodox aquaporins, aquaglyceroporins, peroxiporins and ammoniaporins, of note, AQP11 and AQP12 have a unique evolutionary pathway and are grouped as non-orthodox aquaporins (or superaquaporins). During the last years emerging evidence highlighted the role of AQPs in modulating key processes during inflammation, including immune cell maturation, migration, phagocytosis, and cytokine release, leading to a rising interest about AQPs involvement in inflammatory disorders. Recently, new roles have emerged for AQP3 and AQP9 in the inflammatory response and in the immune system. AQP3 regulates T cell function and macrophage migration, and AQP9 is required for CD8+ T cell longevity and Neutrophil migration, while the NLRP3 inflammasome, a key modulator of the immune response mediating the release of proinflammatory cytokines, is upregulated in sepsis and its activation has been reported to involve AQP3. While most of the studies have been conducted in vitro or in animal models, little has been done by using ex vivo human samples from patients. Moreover, assessing their differential expression might be of translational value in developing novel therapeutical strategies, as well as defining them as easily analyzable biomarkers to be implied in a machine-learning based prognostic algorithms, to enhance screening procedures in a context where a timely diagnosis is the key for survival. The PhD work was carried out following three main aims sharing all the same common point to evaluate the involvement of AQPs in inflammatory disorders. The first aim was to study the expression of AQP3 and AQP9 in circulating human white blood cells, as well as characterize our novel custom designed polyclonal antibody which is going to be implied in flow cytometry analysis to screen for AQP9-expressing sub-population in blood circulating cells. The second aim was to evaluate AQP3 and AQP9 expression, through RT-PCR, in both PBMCs and neutrophils deriving from septic patients to assess their relevance as prognostic and diagnostic biomarkers for the disease by using bio-statistical and machine-learning approaches. To test AQPs as possible pharmacological targets to treat inflammatory disorders such as sepsis, the third aim was focused on characterizing AQPs expression in an Acute Promyelocytic Leukemia (APL) cell line to be used for assessing and evaluating the involvement of AQPs in NLRP3 inflammasome priming and activation in response to noxious stimuli, such as LPS, main component of Gram- bacteria wall.

La sepsi è una patologia multifattoriale definita come una grave e potenzialmente fatale disfunzione organica causata da una risposta inadeguata o deregolata dell'organismo ospite a un'infezione. Il tasso di mortalità intraospedaliera associato alla sepsi rimane superiore al 10%, mentre nei casi di shock settico, la sua complicanza più grave, caratterizzata da insufficienza multiorgano, supera il 40%. Le acquaporine (AQP) sono una famiglia di proteine canale di membrana che facilitano il trasporto di acqua e piccoli soluti neutri attraverso le membrane biologiche, giocando un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare. Nei mammiferi sono state identificate 13 acquaporine (AQP0–AQP12), suddivise in base a caratteristiche filogenetiche e funzionali: acquaporine ortodosse, acquagliceroporine, perossiporine e ammoniaporine. AQP11 e AQP12 presentano un percorso evolutivo unico e sono classificate come acquaporine non ortodosse (o superacquaporine). Negli ultimi anni, studi hanno evidenziato il ruolo delle AQP nella modulazione di processi chiave durante l'infiammazione, tra cui la maturazione delle cellule immunitarie, la migrazione, la fagocitosi e il rilascio di citochine, portando a un crescente interesse per il coinvolgimento delle AQP nei disturbi infiammatori. Recentemente, sono emersi nuovi ruoli per AQP3 e AQP9 nella risposta infiammatoria e nel sistema immunitario. AQP3 regola la funzione dei linfociti T e la migrazione dei macrofagi, mentre AQP9 è necessaria per la longevità delle cellule T CD8+ e la migrazione dei neutrofili. Inoltre, l'inflammasoma NLRP3, un modulatore chiave della risposta immunitaria che media il rilascio di citochine proinfiammatorie, risulta sovraregolato nella sepsi e AQP3 è stata riportata essere coinvolta nella sua attivazione. Sebbene la maggior parte degli studi sia stata condotta in vitro o su modelli animali, pochi studi sono stati eseguiti utilizzando campioni umani ex vivo provenienti da pazienti. Inoltre, valutare l’espressione differenziale di AQP3 e AQP9 nelle PBMCs e nei neutrofili potrebbe avere un valore traslazionale nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche, oltre a definirle come biomarcatori facilmente analizzabili da impiegare in un sistema prognostico basato su algoritmi di Machine-Learning utili a velocizzare le procedure diagnostiche in contesti di medicina d’urgenza. Il lavoro di dottorato è stato svolto seguendo tre obiettivi principali, tutti accomunati dall'intento di valutare il coinvolgimento delle AQP nei disordini infiammatori. Il primo obiettivo è stato studiare l'espressione di AQP3 e AQP9 nei globuli bianchi umani circolanti, oltre a caratterizzare il nostro nuovo anticorpo policlonale progettato, che verrà utilizzato nell'analisi mediante citometria a flusso per individuare sottopopolazioni di cellule circolanti che esprimono AQP9. Il secondo obiettivo è stato valutare l'espressione di AQP3 e AQP9, mediante RT-PCR, sia nelle PBMC che nei neutrofili derivati da pazienti settici, per valutarne la rilevanza come biomarcatori prognostici e diagnostici della malattia utilizzando approcci biostatistici e di Machine-Learning. Per testare le AQP come possibili target farmacologici per il trattamento di disordini infiammatori come la sepsi, il terzo obiettivo si è concentrato sulla caratterizzazione dell'espressione delle AQP in una linea cellulare di leucemia promielocitica acuta (APL), da utilizzare per valutare il coinvolgimento delle AQP nel priming e attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in risposta a stimoli nocivi, come LPS, principale componente della parete dei batteri Gram-.