METODI ANALITICI ULTRASENSIBILI PER LA RILEVAZIONE DI BIOMARCATORI CLINICAMENTE RILEVANTI

The PhD research activity is focused on the implementation and optimization of Single-Molecule Transistor (SiMoT) technology. The device's high sensitivity, selectivity, rapid response, and low production cost make it an ideal candidate for advanced point-of-care (POC) testing applications. The project also involved the validation of the SiMoT technology against the Single Molecule Array (Simoa® ) SP-X system. Indeed, the implementation and characterization of the SiMoT platform was performed by specifically functionalizing the bioelectronic sensor with antibodies to detect the Interleukin-6 (IL-6) protein. The process was based on the selective interaction between the antibody and its ligand, namely the IL-6 protein. Both platforms were used for IL-6 detection in standard buffer solutions and real serum samples. The SiMoT device provided a limit of detection (LOD) three orders of magnitude lower than the Simoa® technology for IL-6, in 0.1 mL of assayed sample. Further development of the SiMoT platform allowed for simultaneous analysis of various markers and patient fluids with a multiplexing approach. To this aim, a SiMoT array was developed within the four-year European project "Single-Molecule Bioelectronic Smart System Array for Clinical Testing" (SiMBiT). The platform was implemented to identify early pancreatic cancer precursor biomarkers and classify associated mucinous cysts. The sensor design foresaw an array of 96 bioelectronic sensors, resembling a standard ELISA plate, and a disposable 3D-printed gate array cover to hold the 96 gold electrodes functionalized with relevant biorecognition elements. A machine-learning algorithm was integrated to classify samples in different class: non-mucinous, low-grade, and high-grade cysts. For the first time, the platform was also tested for RNA detection, specifically focusing on the subgenomic RNA (sgmRNA) of SARS-CoV-2, expanding its application from tumor biomarkers to infectious disease monitoring. The scalability of the SiMoT platform was supported by exploring cost-effective methods for sensor biofunctionalization. Specifically, the physisorption of antibodies onto the sensor’s gate electrode was optimized and assessed using Surface Plasmon Resonance (SPR) techniques. The SPR analysis confirmed the stability and uniformity of the antibody layers, achieving optimal surface coverage (95%) within just 8 minutes under low ionic strength conditions. Furthermore, the long-term stability of these physisorbed antibodies was demonstrated in both physiological and non-physiological storage conditions, highlighting the robustness and scalability of this approach. The findings suggest that the SiMoT portable prototype, which is fast, label-free, and highly sensitive, holds promise for developing effective POC devices capable of large-scale screening of several biomarkers.

L'attività di ricerca di dottorato sì è incentrata sull'implementazione e l'ottimizzazione della tecnologia Single-Molecule Transistor (SiMoT). L'alta sensibilità, selettività, risposta rapida e basso costo di produzione del dispositivo lo rendono un candidato ideale per applicazioni avanzate di test di tipo point-of-care (POC). Il progetto ha inoltre previsto la validazione della tecnologia SiMoT rispetto alla piattaforma Single Molecule Array (Simoa® ) SP-X. L'implementazione e la caratterizzazione della piattaforma SiMoT sono state eseguite funzionalizzando specificamente il sensore bioelettronico con anticorpi per rilevare la proteina interleuchina-6 (IL-6). Il test si è basato sull'interazione selettiva tra l'anticorpo e il suo ligando, ovvero la proteina IL-6. Entrambe le piattaforme sono state utilizzate per la rilevazione di IL-6 in soluzioni tampone standard e campioni di siero reale. Il dispositivo SiMoT ha fornito un limite di rilevazione (LOD) tre ordini di grandezza inferiore rispetto alla tecnologia Simoa® per l'IL-6, in 0,1 mL di campione testato. La piattaforma SiMoT è stata ulteriormente implementata nell'analisi simultanea di diversi marcatori e fluidi di pazienti attraverso un approccio di tipo multiplexing. A tal fine, è stato sviluppato un array SiMoT nell'ambito del progetto europeo quadriennale "Single-Molecule Bioelectronic Smart System Array for Clinical Testing" (SiMBiT). La piattaforma è stata implementata per l'identificazione precoce di biomarcatori precursori del cancro al pancreas e la classificazione delle cisti mucinose associate. Il design del sensore prevedeva un array di 96 sensori bioelettronici, simile a una piastra ELISA standard, e una matrice di gate stampata in 3D monouso comprendente 96 elettrodi d'oro funzionalizzati con gli elementi di bioriconoscimento specifici per ciascun biomarcatore (MUC-1, CD-55, KRASmut). Un’analisi esploratoria multivariata e un algoritmo di machine learning sono stati sviluppati per classificare i campioni in tre classi: cisti non mucinose, cisti mucinose di basso grado e cisti mucinose di alto grado. Inoltre, la stessa piattaforma è stata testata per la prima volta per la rilevazione dell'RNA, concentrandosi specificamente sull'RNA subgenomico (sgmRNA) del SARS-CoV-2, ampliando ulteriormente il suo campo di applicazione dai biomarcatori tumorali al monitoraggio delle malattie infettive. La scalabilità della piattaforma SiMoT è stata supportata dall'esplorazione di metodi economici per la biofunzionalizzazione dei sensori. Nello specifico, il fisiosorbimento di anticorpi sull'elettrodo di gate del sensore è stato ottimizzato e valutato utilizzando tecniche di Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR). L'analisi SPR ha confermato la stabilità e uniformità degli strati di anticorpi fisisorbiti, raggiungendo una copertura ottimale della superficie (95%) in soli 8 minuti in condizioni di bassa forza ionica. La stabilità a lungo termine di questi anticorpi fisiosorbiti è stata dimostrata sia in condizioni di conservazione fisiologiche che non fisiologiche, evidenziando la robustezza e scalabilità di questo approccio. I risultati suggeriscono che il prototipo portatile SiMoT, label-free e altamente sensibile, si presta quindi allo sviluppo di dispositivi POC efficaci, in grado di eseguire screening su larga scala per diversi biomarcatori.