Cellule Killer Indotte da Citochine: dalla caratterizzazione molecolare alla traslazione clinica

Cytokine-Induced Killer (CIK) cells are a heterogeneous population of ex vivo expanded and activated T lymphocytes, which acquire the expression of CD56 during expansion, and show several functional and phenotypical properties of both T and natural killer cells. CIK cells are obtained in vitro from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or cord blood, by adding recombinant human interferon-γ (rhIFN-γ), anti-CD3 monoclonal antibody (mAb) and recombinant human interleukin-2 (rhIL-2). Importantly, CIK cells do not require antigen-specific stimuli to recognize tumor cells, exert a potent major histocompatibility complex (MHC)-unrestricted antitumor activity against both solid and hematologic malignancies, and have shown very low risk of acute graft versus host disease in the clinical setting. One of the major hurdles of cellular therapies is the huge amount of cell numbers required to achieve successful clinical responses. In this regard, G-Rex® devices represent an efficient culture system to ensure the expansion of such a high number of cells. In this study, we developed an innovative serum-free protocol for optimal expansion of CIK cells form healthy donors in G-Rex, in terms of cell growth, viability, phenotype, and lytic activity. Interestingly, CIK cells cultured in G-Rex showed a pronounced immature phenotype compared to standard culture protocols. Moreover, we successfully expanded CIK cells from B-cell lymphoma patients in G-Rex devices, even starting from blood samples containing very low percentages of CD3+ T cells, by adding the bispecific antibody Blinatumumab (CD3xCD19) to the cultures to eliminate the residual tumor cells (CD19+). Overall, this protocol represents an improvement over the existing procedures, as it provides a more simplified and cost-effective approach for the production of clinically-compliant CIK cells. We next improved the CIK cell cytotoxicity against CD20+ patient-derived samples, both in vitro and in vivo, by the combination with the anti-CD20 antibody Obinutuzumab (OBI), triggering the antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC) due to CD16a expression on CIK cells. We further transfer this combination approach against the aggressive triple negative breast cancer (TNBC). CIK cells combined with the anti-EGFR antibody Cetuximab (CTX) were effective in delay the tumor growth in a fat pad-established patient-derived EGFR+ TNBC xenograft mouse model, but more important, in MDA-MB-231 mouse model where the primary tumor were surgically removed, the growth of metastases in lymph nodes and lungs was significantly delayed and mice had a significant better survival. These results establish good premises to successfully translate the proposed therapeutic approach to the clinical setting. In all our studies, we observed that CIK cells isolated from different healthy donors, display heterogenous mAb-dependent cytotoxicity against tumors. We believe that a deep molecular profiling of CIK cells is important to better characterize the effector population and improve the clinical potential. In this study, we stratified CIK cell donors in Best Donors (BD), endowed with the highest cytotoxicity, and Worst Donors (WD), displaying a lower killing activity and we provided a preliminary characterization in terms of phenotypic profile and cytokine secretion. Results indicated differences between BD and WD in the expression of some interesting molecules related to the glycolytic metabolism and integrin signaling which are associated to an altered cytotoxic activity. Current studies at the gene expression level are ongoing to confirm and further investigate differences among BD and WD. The final aim is to promptly select PBMC donors before the culture and the differentiation into CIK cells, which will have the highest killing capacity to stem a better therapeutic success.

Le cellule Killer Indotte da Citochine (CIK) sono una popolazione eterogenea di linfociti T espansi e attivati ex vivo, che diventano CD56+ durante la coltura e mostrano diverse proprietà funzionali e fenotipiche appartenenti a cellule T e natural killer. Le cellule CIK si ottengono in vitro a partire da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) e sangue cordonale, e vengono espanse tramite l’aggiunta interferone-γ, anticorpo monoclonale anti-CD3 ed interleuchina-2. Le cellule CIK non richiedono stimoli antigenici per il riconoscimento tumorale ed esercitano una potente attività antitumorale non ristretta al complesso maggiore di istocompatibilità. Le cellule CIK si sono inoltre dimostrate molto sicure in ambito clinico. Uno dei principali ostacoli nel contesto delle terapie cellulari è rappresentato dall'enorme quantità di cellule necessarie. In questo senso, i dispositivi G-Rex® rappresentano un efficiente sistema di coltura per garantire l'espansione di numeri elevati di cellule. Nel presente studio, abbiamo sviluppato un protocollo innovativo e privo di siero, per l'espansione ottimale di CIK nei dispositivi G-Rex in termini di crescita cellulare, vitalità, fenotipo e attività litica. Inoltre, CIK coltivate in G-Rex hanno mostrato un fenotipo particolarmente immaturo. Nel complesso questo protocollo rappresenta un miglioramento rispetto alle procedure esistenti, in quanto fornisce un approccio più semplificato ed economico per la produzione di CIK per uso clinico. Abbiamo inoltre esplorato nuove strategie per migliorare l'attività citotossica delle cellule CIK espanse secondo le Buone Pratiche di Laboratorio, mediante la combinazione con anticorpi in uso clinico contro tumori ematologici. In questo studio abbiamo espanso con successo le cellule CIK da pazienti con linfoma a cellule B, anche partendo da campioni contenenti percentuali molto basse di cellule T CD3+. La combinazione di cellule CIK con l'anticorpo anti-CD20 Obinutuzumab ha inoltre mostrato un’ottima efficacia terapeutica in vivo in un modello di xenotrapianto derivato da un paziente affetto da linfoma mantellare CD20+. Abbiamo poi traslato ai tumori solidi la strategia terapeutica proposta, focalizzandoci sull’aggressivo carcinoma mammario triplo negativo (TNBC). Le cellule CIK combinate con l'anticorpo anti-EGFR Cetuximab (CTX) hanno dimostrato efficacia nel ritardare la crescita tumorale di un modello di xenotrapianto derivato da una paziente di TNBC. La terapia si è dimostrata efficacie anche contro la disseminazione metastatica in un modello murino generato con una la linea di TNBC, e ha aumentato la sopravvivenza degli animali. In sintesi, i nostri risultati pongono buone premesse per traslare l'approccio terapeutico al contesto clinico. In tutti i nostri studi, abbiamo osservato che le cellule CIK isolate da diversi donatori sani, mostrano una citotossicità anticorpo-dipendente piuttosto eterogenea. Riteniamo quindi che la caratterizzazione molecolare delle cellule CIK sia importante al fine di migliorarne il potenziale clinico. In questo studio, abbiamo stratificato i donatori di cellule CIK in Best Donors (BD), dotati della più alta citotossicità, e Worst Donors (WD), che mostrano una minore attività litica, e abbiamo fornito una caratterizzazione preliminare in termini di fenotipo e secrezione di citochine. I risultati hanno indicato differenze tra BD e WD nell'espressione di alcune interessanti molecole legate al metabolismo glicolitico e alla segnalazione delle integrine, entrambe funzioni associate ad un'alterata attività citotossica, e sono in corso studi a livello di espressione genica per confermare e approfondire queste differenze. L'obiettivo finale sarà quello di selezionare tempestivamente i donatori di PBMC prima della coltura e del differenziamento in cellule CIK, che avranno un’elevata attività citotossica in modo da garantire un migliore successo terapeutico.