Sviluppo di una strategia per la diagnosi molecolare dell'anemia di Fanconi

L'anemia di Fanconi (FA) e? una malattia genetica rara caratterizzata da malformazioni congenite, pancitopenia, predisposizione al cancro e aumentata sensibilita? ad agenti, quali diepossibutano e mitomicina C, che formano legami tra i due filamenti di DNA. La FA e? causata da almeno 16 geni che costituiscono, insieme ad altri componenti, un pathaway di riparazione del DNA. L'eterogeneita? e? uno dei principali motivi che complica la diagnosi molecolare della FA. E' pertanto necessario un processo a piu? livelli che implica lo screening di molti esoni o, in alternativa, l'allestimento di linee cellulari e l'analisi di complementazione per la caratterizzazione del gene candidato. Gli scopi di questa tesi pertanto sono diretti a: †¢ Ridurre i tempi per l'identificazione del gene mutato sostituendo l'analisi di complementazione con quella di espressione delle proteine FA basandosi sul presupposto che prodotti mutati siano rapidamente degradati; †¢ Caratterizzare dal punto di vista molecolare gli effetti delle varianti identificate dall'analisi di sequenza. Per quanto riguarda il primo obiettivo, ci siamo focalizzati sullo studio della proteina FANCA in 44 linee cellulari linfoblastoidi appartenenti ai diversi gruppi di complementazione. E' emerso che, fatta eccezione per FA-G, l'espressione di FANCA non e? alterata da mutazioni nei geni FANCB, FANCC e FANCD2. Per quanto riguarda i pazienti con mutazioni in FANCA, invece, abbiamo osservato una correlazione tra il tipo di mutazione e il livello di espressione della proteina che puo? quelli essere paragonabile a quella dei controlli nel caso di mutazioni missenso o ampie delezioni in frame. In accordo con l'ipotesi invece, in presenza di mutazioni nonsenso e frameshift in entrambi gli alleli del gene, non si ha produzione di proteina. Sulla base di questi dati possiamo concludere che l'analisi di FANCA non e? soddisfacente per assegnare ai pazienti il corrispondente gruppo di complementazione. Tuttavia, da questo studio e? emersa l'ipotesi di un'associazione tra l'espressione stabile delle proteine FANCA mutate e un ??fenotipo meno grave nei pazienti. I dati preliminari dimostrano che queste proteine non sono traslocate nel nucleo e che quindi un'eventuale attivita? residua non sia da attribuire al processo di riparazione del DNA. Un potenziale ruolo andrebbe forse indagato a livello citoplasmatico dove, come sta emergendo dalla letteratura, almeno FANCG e FANCC, svolgono una funzione all'interno del mitocondrio tale da giustificare l'elevato grado di stress ossidativo delle cellule FA. Per il secondo obiettivo, lo studio dei casi arruolati nell'ambito dell'AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica) ha consentito l'identificazione delle mutazioni in 100 famiglie. Dall'analisi dei dati emerge che la maggior parte delle mutazioni colpisce il gene FANCA (85%), seguito da FANCG (9%), FANCC (3%), FANCD2 (2%) e FANCB (1%). In assenza del dato di complementazione e/o in presenza di varianti alle quali non e? sempre possibile attribuire un chiaro effetto patogenetico, sono state eseguite ulteriori indagini. Si citano a titolo di esempio la caratterizzazione delle ampie delezioni intrageniche mediante MLPA, l'analisi bioinformatica e a livello di RNA delle alterazioni di splicing che, qualora in frame, sono state ulteriormente confermate anche a livello proteico e, infine, lo studio bioinformatico di patogenicita? delle sostituzioni aminoacidiche. La formulazione di un algoritmo efficace e rapido per la diagnosi molecolare della FA, nonche? la chiara definizione del significato patogenetico delle varianti identificate, e? molto importante per corretta presa in carico del paziente e della famiglia sia per l'identificazione dei portatori che per la diagnosi prenatale.