Attività microbicida dei neutrofili : i meccanismi cellullari e molecolari e loro disfunzioni

In questa tesi ci siamo proposti di riesaminare i meccanismi implicati nell'attività  microbicida dei neutrofili, alla luce delle nuove ipotesi proposte recentemente, impiegando una metodica corretta di misura del killing microbico da noi recentemente messa a punto. Nel complesso, i risultati da noi ottenuti provano che l'attività  NADPH ossidasica ਠindispensabile per il killing di certi microrganismi (quali S. aureus e C. albicans) ma non per altri (quali E. coli) che sono uccisi efficacemente anche in assenza di burst respiratorio. I flussi di ioni potassio e l'alcalinizzazione del pH intrafagosomale, indotti dall'attivazione del complesso ossidasi, non sono necessari al killing di S. aureus e C. albicans, il cui killing NADPH ossidasi-dipendente ਠmediato quasi esclsivamente dalla mieloperossidasi. Le correnti di ioni K+ sembrano responsabili dell'attività  microbicida residua dei neutrofili MPO-deficienti, a lunghi tempi di incubazione. I meccanismi implicati nell'attività  microbicida dei neutrofili sono stati studiati anche ricorrendo ad un modello sperimentale ampiamente utilizzato in letteratura per le ricerche sul funzionamento del complesso NADPH ossidasi: la linea cellulare PLB-985 differenziabile in neutrophils-like. In questo contesto, i risultati da noi ottenuti suggeriscono che la produzione di ROS da parte delle linea cellulare PLB-985 in risposta a stimoli particolati (microrganismi opsonizzati) ਠsensibilmente pi๠debole rispetto ai PMN. Tale burst respiratorio ਠresponsabile di un'attività  microbicida, nei confronti di microrganismi sensibili ai meccanismi di killing ossigeno-dipendenti (S. aureus e C. albicans), paragonabile a quella dei PMN a tempi brevi di incubazione; prolungando i tempi di fagocitosi, il potere microbicida di queste cellule risulta invece abolito. Nei confronti di E. coli, battere sensibile ai processi di killing ossigeno-indipendenti, l'attività  microbicida delle cellule PLB-985 risulta parzialmente difettosa se paragonata ai neutrofili La super-produzione di anioni superossido, evidenziata nelle cellule PLB-985 DloopNox4-Nox2 (cellule in cui la seconda ansa intracellulare di No2 à© sostituita da quella dell'ossidasi omologa Nox4) in risposta a stimoli solubili e particolati, non ਠaccompagnata da un'aumentata capacità  microbicida di queste cellule nei confronti di S. aureus, C. albicans ed E. coli. Nelle cellule PLB-985 i processi microbicidi non ossidativi risultano compromessi, a causa della carenza parziale (MPO, elastasi, catepsina G, ?-glucuronidasi, CD11b) o totale (lattoferrina, lisozima, MMP-8, MMP-9) degli enzimi e delle proteine granulari coinvolti nell'attività  antimicrobica e a causa della loro difettosa esocitosi.. In particolare, i nostri risultati suggeriscono un difetto a livello della biogenesi dei granuli specifici e terziari. Il ridotto funzionamento del complesso enzimatico NADPH ossidasi ਠalla base di una rara malattia genetica, la malattia granulomatosa cronica. Parte di questo lavoro di tesi ਠstata dedicata alla caratterizzazione di un caso atipico di CGD, la forma X91-. I risultati ottenuti ci hanno permesso di dimostrare che la nuova mutazione da noi descritta nel promotore del gene CYBB (inserzione di una T nella posizione da -54T a -57T) à© responsabile della ridotta associazione dei fattori di trascrizione ets con la regione promotrice, impedisce una normale espressione del gene nei neutrofili dei pazienti ed à© correlata alla ridotta attività  ossidasica misurata in tutta la popolazione di granulociti; l'espressione e l'attività  funzionale della NADPH ossidasi appaiono invece normali negli eosinofili, suggerendo che l'espressione di gp91phox in queste cellule à© regolata da fattori di trascrizione differenti da quelli operanti nei neutrofili. Infine, l'attività  ossidasica residua (5-7% del normale) non à© di per sà© sufficiente a garantire un'attività  di killing nei confronti di S. aureus e C. albicans e a proteggere il paziente contro le infezioni .