Glucose coated nanoparticles for mesenchymal cancer cells recognition

Lo scopo del presente progetto di Dottorato riguarda la possibilità  di riconoscere ed identificare le cellule mesenchimali del cancro sfruttando il metabolismo iper-attivato, nonchà© de-regolato, delle stesse. Una delle differenze principali tra le cellule epiteliali e quelle mesenchimali, del cancro, ਠil metabolismo ed in particolare il cosଠdetto Effetto Warburg (da Otto Einrich Warburg il suo scopritore e sostenitore, nel 1926). Nello specifico, questo effetto riguarda la caratteristica delle cellule tumorali di preferire, come via metabolica, la glicolisi alla classica fosforilazione ossidativa, anche in presenza di ossigeno. Questo processo, infatti, porta a produzione ed accumulo di acido lattico e ad una riduzione della quantità  disponibile di glucosio nel mezzo esterno. Negli ultimi anni si ਠscoperto quanti e quali vantaggi competitivi, dal punto di vista proliferativo, comporti questa trasformazione, consentendo cosଠanche lo sviluppo di numerose tecniche terapeutiche e diagnostiche basate proprio sulla trasformazione della fisiologica normalità . Questo progetto di dottorato si ਠproposto di sviluppare una nuova metodica diagnostica in grado di distinguere le cellule mesenchimali del cancro da quelle epiteliali tramite lo studio del loro metabolismo e senza l'ausilio di anticorpi. Essendosi prefisso, infatti, come scopo finale quello di fornire un contributo nel campo della diagnosi preventiva e della prognosi a basso costo; una degli intenzioni principali del presente progetto era quello di ridurre al minimo l'utilizzo di anticorpi nel processo di identificazione dei due sottotipi tumorali. Questo progetto ha cosଠsviluppato un sistema basato su nanoparticelle magnetiche (MNPs), in particolare di cobalto ferrite, con lo scopo di favorire l' avanzamento nel campo delle attuali tecniche di isolamento magnetico. Nello specifico le MNPs sono state sintetizzate e funzionalizzate con un analogo fluorescente del glucosio (il 2-2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose, 2-NBDG) e caratterizzate con spettroscopia infrarossa e microscopia elettronica. Al fine di poterne monitorare in vitro la captazione da parte delle cellule tumorali, sono state utilizzate due ben note linee cellulari di tumore alla mammella, le MCF7 e le MDA-MB-231, definite rispettivamente: epithelial-like e mesenchymal-like. Ne ਠstata valutata la captazione e quindi l'internalizzazione da parte di queste due linee di cancro al seno, dimostrandola con 3 differenti metodiche (microscopia confocale, saggio di immuno-cito-chimica e analisi con microscopia elettronica accoppiata a milling ionico micro-guidato). In particolare ਠstato dimostrato come aumentando la concentrazione di glucosio nel mezzo (da 5.5 a 25 mM), le cellule epiteliali riducano drasticamente l'uptake di MNPs mentre esso si conservi nel sottotipo mesenchimale. Tale differente comportamento ਠinfatti basato sul differente metabolismo dei due sottotipi tumorali, il quale consente, senza l'utilizzo di anticorpi, di individuare il sottotipo mesenchimale, pi๠metabolicamente attivo (e tipicamente pi๠aggressivo), da quello epiteliale. Successivamente ਠstato ricercato il meccanismo molecolare responsabile di tale internalizzazione tramite l'inibizione del pi๠espresso trasportatore di membrana del glucosio, Glut1, con un inibitore selettivo (STF-31). La specifica captazione da parte delle cellule mesenchymal-like ਠstata infine studiata come potenziale caratteristica da sfruttare per eventuali trattamenti di ipertermia, o termoterapia. Nello specifico ਠstato utilizzato un laser infrarosso che focalizzato in maniera accurata e precisa su uno degli aggregati di MNPs (dimensionalmente compatibile con la risoluzione della microscopia ottica), presenti all'interno delle cellule, ne ha permesso l'induzione selettiva di morte (necrosi o apoptosi in base tipicamente al tempo e all'intensità  dell'esposizione). La possibilità  di indurre una morte selettiva nelle cellule tramite la somministrazione di nanoparticelle magnetiche, ਠattualmente ben nota sia in ricerca che in terapia, ma esclusivamente tramite l'ausilio di campi magnetici oscillanti, onde radio o raggi infrarossi non focalizzati. Infine per le applicazioni diagnostiche, che questo progetto si era prefissato, ਠstato studiato e sviluppato un dispositivo microfluidico utile all'isolamento di cellule tumorali tramite il principio di displacement magnetico. Tale dispositivo ਠstato studiato tramite simulazioni a computer ed in seguito prodotto per i successivi test. Ne sono stati valutati i parametri fondamentali ed infine studiato sperimentalmente con biglie magnetiche di dimensioni comparabili alle cellule, riportando infine i calcoli teorici per l'applicazione su campioni contenenti cellule tumorali. Le dimostrazioni applicative che questa tesi di Dottorato ha fornito potranno portare, nel prossimo futuro, ad un avanzamento nel campo della diagnostica del cancro, consentendo di sviluppare sistemi a basso costo e quindi check-up pi๠frequenti e mirati. Infine le prove di ipertermia eseguite, sfruttando le nanoparticelle magnetiche, forniscono interessanti spunti per possibili nuove terapie mirate.