Telomere regulation by microRNAs in human breast cancer

Nei vertebrati i telomeri sono strutture specializzate localizzate all'estremità  dei cromosomi costituito da sequenze ripetute TTAGGG. L' accorciamento progressivo del telomero ad ogni divisione cellulare porta ad una disfunzione telomerica e all'attivazione della risposta di danno al DNA alle estremità  cromosomiche. L'attivazione del segnale di danno al DNA provoca senescenza o apoptosi, fenomeni legati all'invecchiamento. Per mantenere la funzione del telomero il complesso della telomerasi, costituito dalla componente ad RNA (hTERC) e dalla subunità  catalitica (hTERT), aggiunge ripetizioni telomeriche in cellule con alto potenziale replicativo. Due complessi principali sono coinvolti nella regolazione dei telomeri: il complesso shelterin e il complesso della telomerasi. Shelterin ਠcostituito da sei principali proteine: TRF1, TRF2, POT1, TPP1, TIN2 e RAP1, e controlla vari aspetti della funzione telomerica come la lunghezza telomerica, la ricombinazione e la protezione da fattori di risposta al danno al DNA. l'evasione dalla senescenza replicativa raggiunta con la riattivazione della telomerasi, ਠun passaggio chiave nel processo di tumorigenesi, come osservato nel 90% dei tumori umani. Inoltre, aumentano anche le dimostrazioni che indicano il ruolo centrale di shelterin nella formazione e nella progressione del cancro. L'espressione del complesso shelterin o della telomerasi ਠstrettamente regolata a livello trascrizionale e post-traduzionale, anche se il ruolo dei miRNAs nella regolazione dei telomeri non ਠancora stato studiato. Lo scopo del mio progetto di tesi era quello di identificare miRNAs che controllano l'espressione dei componenti di shelterin o del complesso della telomerasi e valutare la rilevanza clinica di questi miRNAs nel contesto del tumore al seno. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo eseguito un high-throughput luciferase reporter screening in cellule HeLa identificando un panello di miRNAs che hanno come bersaglio il 3'UTR di componenti del complesso shelterin (TRF1, TRF2, POT1) o del complesso della telomerasi (TERT, DKC1). Con questo screening abbiamo identificato che l'onco-miRNA miR-155 ਠun efficiente regolatore di TRF1. Il miR-155 ਠup-regolato in tutti i tipi di tumore al seno ed alti livelli del miR-155 correlano con una bassa espressione dei livelli proteici di TRF1. Inoltre, abbiamo validato con ulteriori saggi luciferasi il targeting di TRF1 da parte del miR-155 ed abbiamo anche scoperto che il miR-155 controlla l'espressione di TRF1 a livello traduzionale. Soprattutto, la bassa espressione dei livelli di mRNA di TRF1 e la bassa espressione dei geni bersaglio del miR-155 correlano con una ridotta sopravvivenza libera da metastasi distanti (DMFS) e con una ridotta sopravvivenza libera da recidive (RFS) in pazienti con cancro al seno luminale estrogeno-positivo (ER+). Questo indica che il targeting di TRF1 da parte del miR-155 ਠparte di una signature del miR-155 che determina una scarsa sopravvivenza nel cancro al seno di tipo luminale ER+. Soprattutto abbiamo scoperto che il targeting di TRF1 da parte del miR-155 porta ad un aumento della fragilità  telomerica, a fusioni telomeriche dei cromatidi fratelli e all'allungamento dei telomeri. Il nostro lavoro dimostra per la prima volta che la regolazione post-trascrizionale di TRF1, mediata dal miR-155, ਠun efficiente meccanismo per controllare la fragilità  telomerica e l'instabilità  genomica nel cancro al seno. Invece, per quanto riguarda i miRNAs che regolano la telomerasi nel cancro al seno, abbiamo studiato il miR-296-5p e il miR-512-5p, i quali bersagliano efficientemente hTERT come mostrato dal high-throughput luciferase reporter screening . Entrambi i miRNAs bersagliano specifiche regioni nel 3'UTR di hTERT portando alla degradazione dell'mRNA di hTERT e alla riduzione dell'attività  telomerasica. Dati clinici rivelano che il miR-296-5p e il miR-512-5p sono down-regolati nei tessuti tumorali del seno. Inoltre, abbiamo scoperto che l'aumento dell'espressione di hTERT e l'aumentata espressione dei geni bersaglio del miR-296-5p e del miR-512-5p correlano con una scarsa sopravvivenza in pazienti con cancro al seno di tipo basale. Questo evidenzia l'importanza clinica del miR-296-5p e del miR-512-5p nel cancro al seno (basale). A livello molecolare abbiamo mostrato che il miR-296-5p e il miR-512-5p rallentano la proliferazione cellulare e provocano l' accorciamento della lunghezza dei telomeri in cellule di tumore al seno basale. Soprattutto, abbiamo scoperto che la ri-espressione epigenetica dei geni del miR-296-5p e del miR-512-5p in cellule di tumore al seno basale, determina l'aumento dell'espressione del miR-296-5p e del miR-512-5p e la conseguente riduzione dell'espressione di hTERT. I nostri dati suggeriscono che l'utilizzo di composti che inducono la ri-espressione del miR-296-5p e del miR-512-5p potrebbe essere una strategia promettente per compromettere i meccanismi di mantenimento dei telomeri e la funzione di hTERT nel cancro al seno. I risultati di questo lavoro dimostrano che i miRNAs rappresentano dei nuovi regolatori della funzione telomerica e hanno un impatto sull'omeostasi dei telomeri nel cancro umano. Questo lavoro identifica i miRNAs come nuovi bersagli per modulare la funzione dei telomeri nelle malattie ad essi correlate come il cancro e l'invecchiamento.