AVV-mediated delivery of Semaphorin 3A influences tumor miscroenvironment and inhibits tumorigenesis in vivo

Le semaforine di classe 3 costituiscono una piccola famiglia di proteine che sono state inizialmente studiate per la loro capacità  di dirigere la crescita del cono assonico durante lo sviluppo. Tuttavia, tali molecole sono state recentemente coinvolte in ulteriori processi biologici, tra cui merita particolare attenzione il processo angiogenetico, in cui diverse semaforine sembrano partecipare attivamente anche se con ruoli e funzioni variegati. Tale eterogeneità  funzionale ha spesso dato origine a risultati apparentemente contraddittori, dovuti per lo pi๠alla scarsa conoscenza del reale coinvolgimento delle diverse semaforine nell'angiogenesi. Questo studio ਠstato incentrato sul ruolo della semaforina-3A (Sema3A), analizzando nel dettaglio i mutamenti apportati al microambiente locale da una sua overespressione in vivo. Questa proprietà  non ਠstata finora riportata in letteratura e si esplica principalmente attraverso il reclutamento di cellule mononucleate di derivazione midollare. Ciಠਠstato inizialmente osservato nel muscolo scheletrico di topi wild-type a seguito di trasferimento genico della Sema3A mediate tecnologia AAV. Sia a 15 giorni che a un mese dopo l'iniezione del vettore virale ਠstato possibile osservare la presenza di un imponente numero di cellule mononucleate che infiltravano le fibre muscolari. Attraverso analoghi esperimenti mediante vettori AAV, il nostro laboratorio aveva precedentemente dimostrato un simile richiamo di cellule a seguito di espressione di VEGF165, un potente fattore pro-angiogenetico (Arsic et al, Mol. Ther., 2003). Viceversa, molte indicazioni suggerivano che Sema3A fosse in realtà  un fattore anti-angiogenetico, come successivamente ਠstato appurato (Acevedo et al, Blood, 2008 & Zacchigna et al, J.Clin.Invest., 2008). Era perciಠragionevole pensare che i due fattori (VEGF165 e Sema3A) reclutassero in situ due popolazioni cellulari differenti, in grado di accompagnare attività  biologiche contrapposte. Diversi approcci sperimentali, tuttavia, ci hanno condotto a sostenere l'ipotesi che entrambe le molecole in realtà  richiamino la medesima sub-popolazione mieloide agendo attraverso l'attivazione di neuropilina-1 (Nrp-1), un recettore in grado di legare sia VEGF165 che Sema3A. Da notare che VEGF121, un'isoforma del gene VEGF carente dell'esone 7, quando overespressa nel muscolo scheletrico non causa il reclutamento di cellule infiltranti, coerentemente con la sua incapacità  di legare Nrp-1. Oltre a cià², l'espressione ectopica di VEGF121, contrariamente a quanto accade per VEGF165, non determina la formazione di arteriole (vasi di media grandezza, ricoperti da cellule della parete vascolare come periciti e cellule muscolari lisce), pur causando un eguale aumento del letto vascolare attraverso iper-proliferazione capillare. Ciಠci ha indotto a pensare che la presenza di cellule richiamate attraverso Nrp-1 (chiamate da noi NEM) sia in realtà  indispensabile per la maturazione dei vasi neo-formati. In effetti, la co-iniezione di AAV-VEGF121 e NEM ci ha permesso di osservare a 15 giorni un fenotipo chiaramente arteriogenico (presenza di vasi ?-SMA+), contrariamente al fenotipo esclusivamente capillogenico determinato dalla sola iniezione di AAV-VEGF121. Attraverso una caratterizzazione estensiva delle cellule richiamate da VEGF165 o Sema3A, abbiamo potuto riconoscere i NEM come una popolazione mieloide precedentemente mai descritta e differente da altre popolazioni midollari coinvolte nell'angiogenesi. In aggiunta, attraverso l'analisi della loro espressione genica abbiamo potuto riconoscere alcuni geni tipicamente espressi da macrofagi polarizzati in senso M1, noti per essere pro-infiammatori e anti-tumorigenici. I NEM sono stati inoltre visti esprimere alti livelli di PDGF? e TGF?, due molecole coinvolte nella maturazione vascolare. Il fenotipo M1-like e la capacità  di indurre la maturazione della vascolatura sono entrambe caratteristiche potenzialmente in grado di influire negativamente sulla crescita tumorale. Abbiamo quindi deciso di investigare pi๠nel dettaglio come il reclutamento di questo particolare tipo cellulare influisse su un modello tumorale ottenuto tramite xenotrapianto di cellule singeniche direttamente nel muscolo scheletrico. Muscolo precedentemente condizionato mediante trasferimento genico di VEGF165, VEGF121 o Sema3A. In linea con l'ipotesi da dimostrare, la precedente espressione di VEGF165 o Sema3A rende meno efficace l'attecchimento del tumore, rallentandone la crescita, mentre il trasferimento del gene codificante per VEGF121 addirittura accelera tale crescita, come d'altra parte prevedibile per un fattore angiogenetico. Una dettagliata analisi morfologica della rete vascolare tumorale ci ha permesso di constatare come il richiamo di NEM mediante pre-condizionamento da Sema3A causasse una pi๠matura struttura vascolare (in termini di mural cell coverage, di dimensioni e di tortuosità  dei vasi). Per avvalorare definitivamente il ruolo dei NEM nell'inibizione tumorale osservata dopo trasferimento genico, abbiamo purificato tali cellule direttamente da muscoli scheletrici di topi precedentemente iniettati con AAV-Sema3A. Tali cellule sono poi state amministrate direttamente in masse tumorali in crescita in topi singenici. Esse sono risultate effettive nel rallentare la crescita tumorale in fasi tardive, consistentemente con una loro capacità  di sostenere la maturazione della vascolatura tumorale. Un'analisi pi๠approfondita di ha permesso di rilevare diversi segni di una †œnormalizzazione†� vascolare a seguito della somministrazione dei NEM, essendo i vasi pi๠maturi, meno dilatati, meno tortuosi e, dato importante, meno permeabili.