Libraries of short receptors peptides and antibodies for the recognition of small organic molecules

La presente tesi di Dottorato riporta i risultati di ricerche svolte nell'ambito di alcune collaborazioni tra Università  ed industria nel campo della progettazione e sviluppo di librerie di trasduttori primari per biosensori. In particolare l'attenzione si ਠrivolta da un lato a piccoli peptidi come recettori di xanthine (caffeina e teofillina), dall'altro ad una molecola di grandi dimensioni, la palitossina, verso la quale al momento sono stati preparati anticorpi con tecniche pi๠convenzionali. Il contributo di un chimico in questo tipo di progetti ਠanalogo, e consiste in un'attività  di sintesi di derivati modificati delle molecole di interesse, nella loro bioconiugazione a proteine ed enzimi, nella sintesi di peptidi, nello studio dell'interazione ligando-recettore attraverso misure di attività , analisi conformazionale e strutturale, modellizzazione. L'attività  svolta ਠbrevemente descritta nei punti seguenti. 1) I coiled-coil sono motivi strutturali presenti in natura dati dall'unione di due o pi๠?-eliche avvolte su loro stesse al fine di generare un'unica super-elica. L'analisi di tali strutture rivela spesso la presenza di sequenze ripetute di 7 amminoacidi ripetuti (g-a-b-c-d-e-f) con precise caratteristiche: la posizioni a e d per esempio sono occupate sempre da amminoacidi con caratteristiche idrofobiche, atti a generare una interfaccia idrofobica interna alla super-elica molto stabile e non esposta al solvente esterno. Parallelamente, le posizioni e e g sono invece occupate da amminoacidi polari carichi che si trovano sulla superficie esterna della super-elica e possono iteragire tra di loro rinforzando l'interazione e provocando effetti di orientamento. La nostra attenzione si ਠfocalizzata sul coiled-coil denominato EK, sviluppato agli inizi degli anni '90 da Hodges e colleghi. In questa struttura due catene peptidiche denominate appunto E e K si avvolgono su loro stesse al fine di generare una super-elica anfipatica di notevole stabilità .Partendo da tale struttura e sfruttando la tecnica biomolecolare del phage display che permette l'esposizione di strutture a carattere proteico sulla superficie di un batteriofago, sono state create librerie di EK mutati con l'obiettivo di generare all'interno della super-elica siti recettoriali eventualmente utilizzabili all'interno di biosensori come trasduttori primari per caffeina e teofillina, due piccole molecole organiche altamente correlate e ampiamente presenti nella vita quotidiana. E' stata prodotta una prima libreria fagica di dimensioni notevoli (108 elementi), all'interno della quale sono stai isolati due cloni specifici per le xanthine; i due cloni sono stati denominati E1 ed E8. La caratterizzazione del binding ਠavvenuta sia con tecniche biomolecolari che prevedono l'immobilizzazione dell'analita su superficie solida (test ELISA e dot-blot), sia con teniche chimiche con analiti liberi e privi di modificazioni strutturali. Al fine di ridurre il pi๠possibile le dimensioni dello scaffold di partenza ਠstata sviluppata una seconda libreria fagica in cui ਠstata randomizzata soltanto la catena K dell'originario EK proposto da Hodges. La libreria finale presenta una dimensione di 108 elementi, tra i quali ਠstato isolato e caratterizzato attraverso test ELISA il clone denominato KE1. Le ridotte dimensioni di tale peptide (35 amminoacidi) hanno permesso la sua sintesi chimica su una buona scala (40 mg), una cartterizzazione strutturale attraverso spettroscopia di dicroismo circolare, un'analisi dell'interazione in soluzione con la teofillina sfruttando sempre la tecnica CD e quella calorimetrica ed infine un'analisi cristallografica attraverso luce di sincrotrone. 2) Una seconda parte del lavoro ਠstata finalizzata, invece, allo sviluppo di pool anticorpali mono- e policlonali quali trasduttori primari in biosensori per l'individuazione della palitossina. Tale tossina algale con elevato indice di pericolosità  (LD50=0.45 ?g/kg) negli ultimi anni ha causato notevoli disagi in campo ambientale, inquinando flora e fauna acquatica di diverse zone marittime, compreso il Mediterraneo e l'alto Adriatico. Per lo sviluppo di anticorpi specifici contro tale tossina, sono state condotte immunizzazioni su coniglio e su topo con palitossina coniugata a due tipi di proteine carrier (BSA e KLH) al fine di ridurre la sua tossicità  e indurre una risposta immunitaria nell'animale. Il pool anticorpi policolnali di siero di coniglio ਠstato isolato e caratterizzato attraverso sandwich ELISA contro palitossina libera e palitossina chimicamente modificata allo scopo di ottimizzare tale tipo di test e utilizzarlo come possibile dosatore nei confronti dell'analita presente in campioni di acqua oppure in sistemi pi๠complessi quali mitili o ulteriore fauna marina.