Studio della tossicità da palitossina e composti analoghi mediante modelli in vitro e in vivo

La Palitossina (PLTX), una delle biotossine marine pi๠tossiche finora note, ਠsaltata agli onori della cronaca in seguito al suo frequente rilevamento in campioni di una microalga tropicale, Ostreopsis ovata, ormai diffusa anche in Mar Mediterraneo, dove sono stati segnalati pi๠volte problemi respiratori in concomitanza alla sua presenza. La tossina ਠstata rilevata anche in molluschi ed altri prodotti ittici, che possono fungere da vettori per l'ultimo anello della catena alimentare, l'uomo. Poichà© in paesi tropicali sono stati segnalati casi di intossicazione gravi, anche letali, in seguito all'ingestione di pesci e crostacei contaminati con PLTXs, si rende necessario monitorare la presenza di questi composti nei prodotti ittici e/o nelle microalghe produttrici, anche in assenza di una legislazione in merito. All'inizio di questo lavoro erano disponibili solo pochi dati relativi alla tossicità  acuta di questo composto, spesso purificato con protocolli non perfezionati. Poichà© anche i dati clinici disponibili non permettevano un'esatta definizione dell'Acute Reference Dose (ARfD), necessaria per determinare i livelli massimi di tossina ammissibili nei prodotti ittici, si ਠdeciso inizialmente di studiare la tossicità  acuta della PLTX (e di un analogo 42-OH-PLTX) dopo somministrazione orale nel topo. I sintomi e le analisi cliniche condotte sui topi hanno indicato un coinvolgimento del sistema neuromuscolare. Questo studio, insieme ad altri pubblicati nel frattempo, hanno permesso agli esperti dell'EFSA di definire la concentrazione di 30 ?g di tossina per Kg di polpa di molluschi quale livello al di sopra del quale si possano manifestare effetti tossici nell'uomo. Si ਠproceduto poi alla messa a punto di due saggi per la determinazione di questi composti: un saggio strutturale di tipo ELISA ed uno funzionale, il saggio emolitico. Il saggio ELISA (sandwich indiretto) ਠstato messo a punto utilizzando l'anticorpo monoclonale 73D3, e un anticorpo policlonale di coniglio prodotto presso l'Università  di Trieste. Il saggio rileva la PLTX in un range di concentrazioni che vanno da 1,25 a 40 ng/ml ed ਠin grado di quantificare con la stessa sensibilità  anche la 42-OH-PLTX, isolata e caratterizzata dal punto di vista chimico durante questo periodo di dottorato dal gruppo del prof. E. Fattorusso (Università  di Napoli Federico II), in un campione di palitossina gentilmente fornitoci dal dr. M. Poli (Maryland, USA). Il saggio ELISA ਠin grado di rilevare anche l'Ostreocina-d, un altro analogo della PLTX, ma a concentrazioni maggiori rispetto a quelle della PLTX (³40 ng/ml). Il mancato rilevamento di acido okadaico, acido domoico, brevetossina-3, saxitossina e yessotossina (tossine che possono essere presenti insieme alla PLTX nei prodotti ittici contaminati) indica la specificità  del saggio. Siamo poi passati alla messa a punto del saggio emolitico, ampiamente usato in letteratura per il rilevamento di PLTX e di composti palitossino-simili. Questo saggio sfrutta la capacità  della tossina di indurre emolisi tardiva probabilmente tramite l'alterazione della Na+/K+-ATPAasi (NAKA). In letteratura, perà², non ਠdisponibile un protocollo standardizzato e la variabilità  dei risultati riportati ਠnotevole. Si ਠpertanto proceduto a realizzare il saggio emolitico, esplorando le variabili che ne influenzano la performance, ottenendo una EC50 = 13,2 pM per la PLTX. Gli anticorpi monoclonale e policlonale anti-PLTX hanno inibito con equa potenza l'emolisi indotta da PLTX e possono quindi essere usati per verificare la specificità  dell'emolisi in campioni incogniti. Dopo aver verificato che anche la 42-OH-PLTX condividesse lo stesso recettore della PLTX mediante un saggio di binding indiretto alla NAKA (EC50 di 28.2 nM e 29.4 nM rispettivamente per 42-OH-PLTX e PLTX), ਠstato eseguito il saggio emolitico anche sulla 42-OH-PLTX, ottenendo dei risultati analoghi (EC50 = 7.6 pM) a quelli della PLTX. Nell'ottica di un utilizzo di questo saggio in situazioni di monitoraggio si ਠvalutata la possibilità  di ridurre i suoi tempi di esecuzione e in tal senso, cambiando la concentrazione salina della soluzione tampone al 62 % di quella normale, si ਠriusciti a ridurre il tempo di incubazione di 4 volte (1 h anzichà© 4 h). La curva concentrazione-risposta ottenuta dopo incubazione di 1 h con la PLTX in tampone al 62 % ਠrisultata perfettamente sovrapponibile a quella ottenuta dopo 4 h di incubazione della tossina in tampone 100%. Al contrario, nessuna delle concentrazioni di PLTX testate ha dato emolisi dopo incubazione di 1 h della tossina in tampone 100%. Questo aspetto ਠparticolarmente interessante perchà© permetterebbe di distinguere l'emolisi dovuta a palitossina da una emolisi aspecifica, semplicemente conducendo il saggio in 1 ora in parallelo nei due tamponi 62 % e 100 %, evitando l'uso di anticorpi anti-PLTX. In particolare, nel caso di un campione ignoto che dia emolisi in PBS al 62 % e non in PBS al 100 %, il risultato fornirebbe un primo indizio della presenza di palitossina, da confermare con metodi di riferimento (LC-MS). Se invece l'emolisi avviene ad entrambe le concentrazioni di PBS, dopo incubazione per 1 ora, essa potrebbe dipendere da un'azione aspecifica non imputabile alla sola palitossina. La presenza di una proliferazione massiccia (6.700.000 di cellule/litro) di Ostreospis cf. ovata nel Golfo di Trieste, ci ha permesso di utilizzare gli anticorpi monoclonale e policlonale per la localizzazione immunocitochimica delle tossine nelle singole cellule di microalghe. Per la prima volta ਠstata cosଠvisualizzata la presenza delle palitossine in cellule di Ostreopsis cf. ovata, che risultano distribuite in tutto il citoplasma. La positività  per le tossine ਠstata verificata in tutte le cellule di Ostreopsis analizzate, mentre nessuna cellule di Coolia monotis osservate ਠrisultata positiva, a conferma della specificità  verso la PLTX del segnale degli anticorpi. L'analisi HR LCMS ha evidenziato la presenza di ovatossine-a, -b, -c, -d/-e, con una forte prevalenza di ovatossinaa (circa 80%, 45-64 pg/cellula), mentre per la prima volta in un campione naturale non ਠstata rilevata la presenza di PLTX. Questi risultati ci hanno permesso di concludere che entrambi gli anticorpi utilizzati sono in grado di riconoscere anche le ovatossine, analoghi della palitossina preponderanti nel Mar Mediterraneo. Inoltre, la tecnica immunocitochimica eseguita direttamente sulle microalghe potrebbe permettere un'allerta precoce della presenza di palitossine, ad esempio prima del loro ingresso/accumulo nella catena alimentare, evitando eventuali problemi per la salute pubblica. Un altro approccio per il rilevamento della tossina ਠstato fatto utilizzando la spettroscopia Raman. La palitossina (il cui spettro Raman ਠstato qui registrato per la prima volta) ਠstata ricercata in singole cellule di Ostreospis, depigmentate con acetone-esano 1:1. Non sono stati riscontrati segnali univocamente attribuibili alle palitossine negli spettri Raman di Ostreopsis, probabilmente a causa della loro uniforme diffusione citoplasmatica, come visualizzato in immunocitochimica. Nelle cellule non depigmentate con acetone:esano 1:1 ਠstata confermata le presenza del carotenoide peridinina. L'analisi Raman di cellule in coltura di Ostreopsis cf. ovata nelle diverse fasi di crescita ha evidenziato forti segnali associabili ad acidi grassi polinsaturi, già  riscontrati in Ostreopsis cf. ovata con altre tecniche. L'analisi HR LC-MS delle cellule in coltura nelle varie fasi di crescita ha mostrato, analogamente alle relative popolazioni naturali, un elevato contenuto di ovatossina-a (circa 55%, 7.5†"19.7 pg/cellula) e minori quantità  di altre ovatossine, con la palitossina presente in tracce (< 0,1 pg/cellula). Si ਠosservato che il contenuto di tossine aumenta con l'età  della coltura, con le cellule in fase senescente (giorno 25 dall'avvio della coltura) contenenti circa il doppio di tossina delle cellule in fase stazionaria (giorno 18).