Ruolo dei canali del K+ herG nello sviluppo neuronale nella fisiopatologia dell'epilessia.

UniversitàƒÂ  degli studi di Trieste Riassunto Ruolo dei canali di K+ hERG nello sviluppo neuronale e nella fisiopatologia dellࢠepilessia Ciclo: XX Coordinatore: Chia.ma Prof.ssa Paola Lorenzon Dottorando: Emanuele Cilia Lo scopo di questa tesi àƒ¨ stato quello di individuare e definire una correlazione fra canali della famiglia ERG e la sindrome epilettica. Le motivazioni che hanno spinto ad affrontare sperimentalmente questo argomento risiedono, da una parte nel crescente coinvolgimento dei canali voltaggio-dipendenti nellࢠepilessia, dallࢠaltra dal fatto che i canali ERG sono altamente espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) di topo e di ratto e sono in grado di controllare lࢠeccitabilitàƒÂ  neuronale. Studi di espressione relativi ai geni e alle proteine di questa famiglia sono stati condotti, nel nostro laboratorio, sul SNC di topo (Guasti et al., 2005). Una prima parte del lavoro oggetto della presente tesi ha avuto pertanto lo scopo di approfondire tali studi di espressione, applicandoli anche a colture organotipiche di midollo spinale, ottenute da topi sia in etàƒÂ  embrionale che neonatale. Tali studi, nei quali àƒ¨ stata verificata lࢠespressione dei canali ERG sia a livello di m-RNA che di proteina hanno evidenziato che tutti i geni (e le proteine) m-erg sono espressi in tali colture, seguendo un preciso pattern spazio-temporale (Furlan et al., 2005). Tali studi hanno inoltre permesso di ipotizzare un ruolo importante della corrente ERG IK(ERG) durante le prime fasi dello sviluppo, essendo espresso in maniera specifica ed etàƒÂ -dipendente solo da alcune specifiche popolazioni neuronali. In seguito, una volta completato lo studio del pattern di espressione dei geni e delle proteine ERG nel SNC di topo e di ratto, àƒ¨ stata avanzata lࢠipotesi che i canali ERG potessero essere coinvolti nel fenomeno epilettico. Pertanto, la seconda parte del lavoro oggetto della presente tesi si àƒ¨ basato sulla analisi della modulazione dei geni erg nellࢠippocampo di topo durante lࢠinduzione di epilessia sperimentale ottenuta tramite lࢠinoculo di acido Kainico e Pilocarpina. Il lavoro sperimentale si àƒ¨ articolato in due fasi: nella prima fase àƒ¨ stato asportato lࢠippocampo di topi inoculati con farmaci epilettogeni (acido Kainico e Pilocarpina) e di topi inoculati con soluzione fisiologica (considerati topi di controllo); nella seconda fase gli ippocampi sono stati tagliati (ad una determinata distanza dal punto Bregma) e sono state asportate tre fette, su cui sono stati eseguiti esperimenti di Real Time PCR al fine di quantificare lࢠespressione dei geni m-erg1, m-erg2 e m-erg3. Nessuno dei tre geni m-erg àƒ¨ stato modulato in modo significativo a seguito delle crisi epilettiche indotte nàƒ© da acido Kainico, nàƒ© da Pilocarpina. Questi risultati apparentemente negativi ci hanno viceversa stimolato a valutare lࢠipotesi opposta, e cioàƒ¨ se alterazioni primitive della funzionalitàƒÂ  dei canali ERG potessero essere in grado di rappresentare il ࢠprimum movensࢠdella malattia epilettica. Nella terza parte della presente tesi, àƒ¨ stata pertanto condotta unࢠanalisi genetica in famiglie affette da epilessia idiopatica valutando eventuali mutazioni del gene herg3, (KCNH7), al fine di valutare un ruolo patogenetico di tale canale in questo tipo di sindrome. La nostra attenzione si àƒ¨ rivolta verso lo studio di questo gene, perchàƒ© risulta lࢠunico, della famiglia ERG, ad essere espresso specificamente nel SNC senza alcuna espressione a livello cardiaco, come accade per herg1. A tale scopo àƒ¨ stato messo a punto un protocollo sperimentale per lࢠanalisi del DNA genomico mediante la tecnica della DHPLC (Denaturyng High Performance Liquid Chromatography) e successivo sequenziamento. Sono stati identificati 3 profili mutati, nelle sequenze relative agli esoni 4 (dominio N-terminale della proteina), 6 (regione comprendente la prima porzione transmembrana) e 13 (porzione C-terminale). Sono state inoltre identificate le specifiche mutazioni nucleotidiche che provocano un cambiamento nella sequenza amminoacidica. In particolare a livello dellࢠesone 13 àƒ¨ risultata un cambiamento nucleotidico a?g, che determina, a livello amminoacidico, un cambio Serina (AA basico)?Glicina (AA neutro). Nellࢠesone 4 la mutazione c?a determina, a livello proteico, una sostituzione dellࢠamminoacido basico Istidina (H) con Asparagina (N), molecola neutra. Il profilo dellࢠesone 6 evidenzia la sostituzione di base a?g in una porzione intronica tra lࢠesone 6 e 7, questo sito risulta di minor interesse rispetto agli altri perchàƒ© non viene espresso. Eࢠstato infine analizzato lࢠeffetto delle mutazioni trovate a livello dellࢠesone 4 e dellࢠesone 13 sulle proprietàƒÂ  elettrofisiologiche e sulla localizzazione cellulare. Questi esperimenti sono stati condotti presso il laboratorio del Prof. E. Wanke (UniversitàƒÂ  di Milano Bicocca). Dallࢠanalisi delle proprietàƒÂ  biofisiche della corrente mediata dai canali codificati dai plasmidi mutagenizzati, àƒ¨ emerso che tutte le correnti mediate dai mutanti presentano uno slittamento della curva di attivazione verso valori piàƒ¹ iperpolarizzati. In cellule neuronali, dove queste proteine sono in grado di regolare la frequenza di scarica, ciàƒ² potrebbe influenzare le proprietàƒÂ  biofisiche alla base dellࢠeccitabilitàƒÂ  cellulare.