Sviluppo di strategie farmacologiche per la personalizzazione della terapia della leucemia linfoblastica acuta nel bambino

L'attività  dell'enzima tiopurina-S-metil transferasi (TPMT) ਠun determinante importante di eventi avversi severi durante il trattamento della leucemia linfoblastica acuta (LLA) con l'antimetabolita mercaptopurina. Recentemente ਠstato dimostrato che la proteina PACSIN2 modula l'attività  di TPMT e la tossicità  indotta da mercaptopurina, mediante un meccanismo molecolare che si ipotizza riguardi la regolazione dell'autofagia. Nell'ambito del protocollo italiano per il trattamento della LLA AIEOP 2009, si vogliono sviluppare strategie farmacologiche (farmacogenetiche, farmacocinetiche e farmacodinamiche) in vitro da integrare agli attuali parametri di risposta del paziente per personalizzare la terapia. Queste strategie comprendono la valutazione dell'attività  e di polimorfismi genetici di enzimi importanti per la biotrasformazione della mercaptopurina, ovvero TPMT ed inosina trifosfato-pirofosfatasi (ITPA), della concentrazione dei metaboliti attivi della mercaptopurina e della sensibilità  in vitro dei blasti dei pazienti raccolti alla diagnosi e trattati con diversi farmaci antitumorali. Si vuole poi validare l'effetto dei polimorfismi di PACSIN2 sull'attività  dell'enzima TPMT. I dati preliminari ottenuti sostengono il ruolo dei polimorfismi d'interesse sulla farmacocinetica della mercaptopurina. In particolare, la casistica considerata finora valida un contributo dello SNP di PACSIN2 rs2413739 sull'attività  enzimatica di TPMT. Lo studio ਠin continuo aggiornamento. Il suo ampliamento e l'integrazione dei dati farmacologici con i dati clinici dei pazienti contribuiranno a comprendere l'impatto di queste variabili farmacocinetiche/farmacogenomiche sull'efficacia e la tossicità  del trattamento con tiopurine. Per determinare se PACSIN2 e l'autofagia contribuiscono alla variabilità  interindividuale nell'attività  di TPMT e nella suscettibilità  alla tossicità  da mercaptopurina abbiamo eseguito degli esperimenti in cellule con meccanismo di autofagia alterato (ovvero fibroblasti murini embrionali, MEF, da topi con ATG7 disattivato) e alterazione di PACSIN2 (cellule NALM6 con silenziamento di PACSIN2). Le cellule con meccanismo di autofagia alterato esprimono costitutivamente livelli pi๠alti di PACSIN2 endogeno; questo avviene anche per altre proteine correlate all'autofagia come p62. Il trattamento con rapamicina induce la degradazione di PACSIN2 nelle cellule con autofagia funzionante, ma non in quelle con meccanismo di autofagia alterato. Il silenziamento dell'espressione di PACSIN2 ha indotto un aumento nel livello basale di autofagia, come documentato dall'accumulo di LC3-II e autofagosomi. La sequenza proteica di PACSIN2 contiene due siti di legame per LC3 e la co-immunoprecipitazione di PACSIN2 e LC3 dimostra l'interazione delle due proteine nelle linee cellulari NALM6. La stabilità  di TPMT ਠdiminuita quando l'espressione di PACSIN2 ਠalterata, in confronto a cellule con livelli normali di PACSIN2. Qui dimostriamo che PACSIN2 ਠbona fide una proteina dell'autofagia e che il suo ruolo come modulatore dell'autofagia influenza la variabilità  interindividuale nell'attività  di TPMT.