Nanoscale platform to study unstructured proteins interactions

Le proteine intrinsecamente disordinate (IDP), nello stato nativo non ripiegate, sono inclini all'aggregazione e direttamente correlate con lo sviluppo di malattie amiloidi. Tra queste, ci siamo focalizzati sullo studio dell'alfa-Sinucleina (AS), una proteina coinvolta nella malattia di Parkinson, un disturbo neurodegenerativo caratterizzato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici e l'accumulo di AS in placche amiloidi. Sebbene lo studio delle interazioni AS-dopamina sia di importanza cruciale nella comprensione dei meccanismi responsabili dello sviluppo della malattia, tuttavia, non sono disponibili dati in letteratura riguardo all'affinità  di questo legame nei diversi stati ripiegati/funzionali dell'AS. L'elevata tendenza all'aggregazione delle IDP rende difficile il loro studio in soluzione e anche una stima approssimativa dei parametri relativi all'affinità  di legame ਠestremamente difficile. Nuove tecniche di superficie potrebbero pertanto permettere lo studio delle interazioni di legame di molecole e di farmaci capaci di favorire/inibire l'aggregazione. In particolare, le tecniche di superficie potrebbero permettere un migliore controllo dell'immobilizzazione di queste proteine, particolarmente instabili in soluzione, e di studiare con alta precisione fenomeni di legame. Con questa visione, la microscopia di forza atomica (AFM) rappresenta un'opportunità . Il nanografting, una tecnica litografica per mezzo AFM, permette l'immobilizzazione di proteine orientate con il preciso controllo dei parametri di immobilizzazione. Con AFM e AFM-nanografting, abbiamo prodotto una nuova piattaforma per lo studio di diversi aspetti dell'aggregazione/interazione dell'AS. Abbiamo quindi studiato l'affinità  di legame tra AS e dopamina misurando variazioni nell'altezza e nella rugosità  della topografia AFM su AS immobilizzata in aree confinate, in funzione della concentrazione di dopamina. Il valore micromolare della costante di dissociazione (Kd) ਠstato inoltre confermato dallo studio dello spiazzamento di un anticorpo legato all'AS in seguito all'aggiunta di dopamina. Sebbene la Kd calcolata con il nostro approccio sia una stima della reale Kd calcolata in soluzione, in quanto influenzata dall'affollamento delle molecole o ai limiti di diffusione, i nostri risultati sono comunque degni di nota. Infine, abbiamo testato il nostro saggio per lo studio delle fasi preliminari dell'aggregazione dell'AS. In particolare, abbiamo osservato come aggregati confinati di AS siano disciolti dall'azione della dopamina, confermando il suo ruolo nell'inibizione della fibrillazione. In questo modo, abbiamo creato un saggio potenzialmente utilizzabile per lo screening di nuove molecole che interagiscono con l'AS ed eventualmente utilizzabili come farmaci. Inoltre, l'interazione di AS con microdomini della membrana cellulare (lipid rafts) sono oggetto di dibattito. Per questo motivo, abbiamo utilizzato dei doppi strati lipidici modello con composizione capace di mimare quella dei lipid rafts. In particolare, abbiamo caratterizzato con AFM e GISAXS (Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering) delle membrane lipidiche di tre componenti, aventi separazione di fase lipidica, studiando l'effetto dell'umidità  e della percentuale di colesterolo su ciascuna fase. Abbiamo quindi studiato l'effetto del legame dell'AS su questo sistema modello. In particolare, immagini di topografia AFM in liquido ci hanno dato la possibilità  di discriminare la topografia di strutture filamentose formatesi inseguito all'interazione di AS. Il fenomeno, dipendente dalla fase lipidica della membrana e quindi dall'ordine delle molecole, sembra essere favorito da un blando impacchettamento dei lipidi. Inoltre, utilizzando misure GISAXS, ਠstato possibile determinare un considerevole riordinamento della membrana in seguito al legame di AS.