Biomolecules as recognition elements for bioactive diterpenes in coffee

Al giorno d'oggi, il caffਠrappresenta una delle principali materie prime commercializzate, la cui produzione mondiale si classifica seconda solo rispetto al petrolio e al primo posto in termini di materia prima alimentare. Essendo interamente prodotto nel Sud del mondo, il caffਠcostituisce la maggiore fonte di guadagno dei Paesi tropicali produttori, in cui viene denominato †œoro verde†�. Il motivo del suo successo mondiale come bevanda deriva dalla sensazione a livello gustativo e olfattivo che suscita in chiunque lo beva e dal suo ben noto effetto stimolante, attribuito principalmente alla caffeina. Per garantire un ottimo prodotto finale, ad esempio in Italia l' Espresso, ਠnecessario garantire e ricercare continuamente la qualità  del caffਠlungo tutta la sua catena di produzione: da †œciliegia†� rossa a bevanda, questa materia prima percorre un lungo cammino in cui subisce molteplici e delicate trasformazioni. Il termine †œqualità  del caffਆ� assume quindi diversi significati a seconda del ruolo che ognuno puಠavere all'interno della catena di produzione. Per la illycaffà¨, nostro partner industriale, qualità  significa bevanda di caffਠcostituita al 100% da Arabica, la specie di caffਠpi๠preziosa in commercio. La sua indiscussa qualità  à¨ dovuta principalmente alle sue caratteristiche organolettiche; infatti l' Espresso derivante da Arabica ਠun caffਠprofumato, dolce, delicato e leggermente acido. Per questo motivo, ਠmolto importante per illycaffਠsalvaguardarsi da possibili frodi o sofisticazioni, ovvero dalla contaminazione di Arabica da Robusta, l'altra specie (meno pregiata) di caffਠpresente in commercio. Per quanto riguarda la composizione chimica, la differenza fondamentale tra le due specie di caffਠਠla presenza, solo nella Robusta, del 16-O-methylcafestolo, diterpene contenuto nella porzione insaponificabile dell'olio di caffà¨. L'assenza di tale composto nell' Arabica fa sଠche esso sia un eccellente †˜molecular marker' per l'identificazione di Robusta in una miscela di caffà¨, rilevandone cosଠla mancanza di autenticità  ove questa sia commercializzata come Arabica 100%. Questo progetto di tesi di dottorato nasce dall'interesse di sviluppare uno strumento capace di riconoscere il 16OMC in una miscela di caffਠtostato, per esempio sfruttando biomolecole, come proteine e peptidi, che già  naturalmente si comportano da recettori, o strutture molecolari progettate su misura con le caratteristiche per interagire selettivamente con i diterpeni. Questo sensore altamente specifico e selettivo per il 16OMC costituirebbe un kit d'analisi rapido ed efficiente in grado di proteggere la illycaffਠda possibili frodi e adulterazioni. Per raggiungere questo obiettivo, per prima cosa ਠstata messa a punto una nuova metodica di estrazione e di purificazione dei diterpeni, principalmente cafestolo e 16OMC, da una miscela di caffਠtostato Robusta 100%, perchà© si tratta di composti non facilmente reperibili sul mercato e molto costosi. I diterpeni estratti sono stati completamente caratterizzati, fornendo nuovi dati e/o confermando i dati già  presenti in letteratura, talvolta incompleti. Inoltre questa metodica ci ha permesso di purificare e caratterizzare anche un altro componente della frazione insaponificabile del caffà¨: il ?-sitosterolo, uno tra i pi๠abbondanti steroli presenti nel caffà¨. Per lo sviluppo di un biosensore selettivo basato sull'interazione di una biomolecola con un composto target, sono stati considerati diversi approcci. Il primo approccio valutato ਠstato quello di partire da una proteina naturale, ben organizzata e stabile, e ridurre le sue dimensioni fino all'ottenimento di un peptide che risulti stabile e mantenga la funzionalità  del sito attivo. In tale prospettiva ਠstata studiata tramite spettroscopia di fluorescenza l'interazione tra diterpeni e albumina umana (HSA), albumina umana priva di acidi grassi (ff-HSA), albumina bovina (BSA) e il recettore nucleare FXR (Farnesoid X Receptor). Gli esperimenti sono stati fatti in condizioni fisiologiche. Per quanto riguarda le albumine, si ਠosservato che i siti coinvolti nell'interazione con i diterpeni sono il sito denominato Sudlow site I, in cui ਠpresente il Trp, causando una alterazione della fluorescenza, e il sito degli acidi grassi, contiguo al sito I, andando a modificare drasticamente la conformazione della proteina. Un'analisi degli spettri di dicroismo circolare registrati in presenza di sola albumina e successivamente aggiungendo diterpeni hanno confermato questo cambio conformazionale. Cafestolo e 16OMC presentano affinità  per le albumine simili a quelle di altre piccole molecole capaci di legarsi ad esse. Tuttavia i dati ottenuti sono stati utili da un punto di vista fisiologico. L'interazione tra cafestolo e FXR, recettore coinvolto nell'omeostasi del colesterolo, ਠstata studiata per ottenere informazioni sull'attività  biologica e per valutare il recettore come un potenziale strumento per la progettazione di biosensori. FXR ਠin grado di legare il cafestolo con una affinità  molto elevata. La costante di dissociazione ottenuta (KD), 50 nM, ਠmolto promettente. E' da considerarsi, tuttavia, come un dato preliminare e studi che confermano questa ipotesi sono ancora in corso. Un ultimo approccio ha riguardato la modifica strutturale dei diterpeni. L'idea ਠquella di legare dei linkers all'anello furanico dei due diterpeni in modo da lasciare liberi il diolo del cafestolo e l'etere del 16OMC, poichà© sono i gruppi funzionali che vogliamo discriminare. Il legame con il linker permette di immobilizzare i diterpeni modificati a supporti solidi, come chip d'oro, e di eseguire rapidamente screening di librerie peptidiche e selezionare i peptidi pi๠promettenti tra i tanti componenti di una libreria. Per questo scopo, dopo protezione degli ossidrili di cafestolo (tramite acetonide) e 16OMC (formazione di etere), ਠstata eseguita l'alchilazione del furano. Tale via ਠancora in fase di sviluppo.