Morfo-anatomia dello sviluppo del seme in Coffea arabica L. cv. Mundo Novo

Questo lavoro mirato allo studio dello sviluppo del seme di Coffea arabica, avvalendosi di differenti tecniche microscopiche, ha cercato di dare un contributo agli studi effettuati precedentemente da Houk (1938), Mendes (1941), Dedecca (1957), Wormer (1966), Dentan (1977, 1985) e De Castro (2002, 2005) che hanno apportato nozioni fondamentali a riguardo. Il campionamento del materiale àƒ¨ stato effettuato da settembre 2006 a giugno 2007 su piante appartenenti al cv. Mundo Novo, allࢠInstituto Agronàƒ´mico di Campinas (IAC, SP, Brasil). Sono stati raccolti quindi circa 60 campioni per ciascun stadio di sviluppo a scadenza bisettimanale dal momento della fioritura fino a completa maturazione del frutto, per un totale di 34 settimane after anthesis (AA). I campioni sono stati quindi subito fissati e spediti in laboratorio a Trieste (Italia). Per prima cosa àƒ¨ stata effettuata lࢠanalisi dimensionale delle drupe su un pool di campioni scelto casualmente tra quelli arrivati in laboratorio usando un calibro digitale lungo tre linee di misura: lunghezza, asse maggiore e asse minore in millimetri, sia per le drupe che per i semi. I campioni selezionati sono stati inclusi in resina Technovit 7100 (dallࢠinizio della fioritura fino alla 20a settimana AA) e tagliati con un microtomo rotativo (sezioni da 6 à,µm). I campioni dalla 22a settimana in poi sono stati tagliati invece con un criostato a bassa temperatura (da -15à,°C a -25à,°C; sezioni da 10-12 à,µm), a causa dellࢠaumento della durezza del materiale. Sulle sezioni preparate sono state usate tecniche standard di osservazione in microscopia (ottica, SEM e TEM) e colorazioni istochimiche (ad es. Toluidin blue-O, Periodic Acid Schiff, DAPI etc.) ed àƒ¨ stata effettuata una messa a punto di protocolli specifici secondo la tipologia di tessuto osservata. I risultati dellࢠanalisi dimensionale hanno permesso di distinguere tre fasi di crescita dei frutti: 1. fase di quiescenza fino a 4 settimane dopo la fioritura (ࢠafter anthesisࢠ, AA); 2. fase centrale di sviluppo rapido (da 6 a 14 settimane AA); 3. fase di maturazione (da 16 settimane AA in poi). La seconda fase àƒ¨ strettamente correlata alle condizioni climatiche del periodo, in particolare allࢠaumento della frequenza delle piogge. Nella fase di crescita lenta lࢠovario osservato in sezione longitudinale presenta la tipica struttura della drupa del caffàƒ¨ con due camere ovariche che ospitano un ovulo anatropo ciascuna. Lࢠovulo àƒ¨ composto da un funicolo, da un unico tegumento proveniente dal tessuto materno e da una zona di pochi micron occupata dal sacco embrionale non ancora sviluppato. Eࢠpresente anche lࢠࢠotturatoreࢠche, in Coffea, àƒ¨ di derivazione funicolare, formato da parenchima, conduce il tubetto pollinico al micropilo. Dopo circa un mese (4a -6a settimana) non si evidenzia ancora una crescita dimensionale del seme degna di nota. Durante la fase centrale di sviluppo rapido il mesocarpo si accresce fino ad uno spessore di 0,6 mm. A 8 settimane il seme ha 2 mm e il sacco embrionale fecondato ha iniziato il suo sviluppo con lࢠaccrescimento dellࢠendosperma, inizialmente di tipo nucleare. A 10 settimane il seme ha 3 mm. Il sacco embrionale àƒ¨ piàƒ¹ grande (0,2 mm) ed àƒ¨ formato da circa una ventina di cellule dellࢠendosperma. A 12 settimane il seme raggiunge i 10 mm. Lࢠendosperma ha circa 1 mm. In questo stadio si nota un particolare strato tissutale che rappresenta la parte del perisperma che diventeràƒÂ  pellicola argentea. In seguito inizia ad intravedersi la pellicola argentea, con alcune cellule ancora vive e nucleate, e il pergamino si sta formando grazie a particolari modificazioni dellࢠendocarpo della drupa. Il seme ha quasi raggiunto la sua dimensione definitiva, alla 14a settimana. Nella fase di maturazione la crescita dimensionale non àƒ¨ piàƒ¹ cosàƒ¬ degna di nota, mentre si osservano cambiamenti chimici e strutturali. La 16a settimana àƒ¨ caratterizzata dalla quasi completa formazione della pellicola argentea, anche allࢠinterno del solco. Molte cellule dellࢠendosperma sono in attivitàƒÂ  mitotica continua. Il pergamino invece àƒ¨ completamente formato a 18 settimane, caratterizzato da fibre fusiformi a pareti spesse. Dalla 20a settimana in poi, il tessuto dellࢠendosperma ormai formato ha ancora le cellule a pareti sottili (3 à,µm). In questa fase delicata il materiale ha caratteristiche intermedie, nàƒ© duro nàƒ© molle; il contenuto vacuolare delle cellule endospermiche si arricchisce di corpi proteici e strutture zuccherine, evidenziate con diverse colorazioni. Lࢠembrione àƒ¨ formato e anche le sue cellule sono ricche di corpi proteici, evidenziati soprattutto con la colorazione UV-Schiff e lࢠosservazione in fluorescenza. Le cellule dellࢠendosperma alla 26a settimana hanno un contenuto vacuolare ancora ricco di proteine e le pareti diventano piàƒ¹ spesse (4-6 à,µm). Si osserva la formazione di alcune nodositàƒÂ  (Dentan, 1977) tipiche delle pareti cellulari dellࢠendosperma, soprattutto vicino alla cavitàƒÂ  embrionale. Lo sviluppo del seme completo viene raggiunto alla 30a settimana, stadio in cui anche lࢠembrione sembra aver concluso la propria maturazione. Le pareti cellulari hanno raggiunto il loro spessore definitivo (da 6 a 10 à,µm). Infine, allࢠultimo stadio (34 settimane AA), le cellule presentano un aspetto differente, risultano quasi piàƒ¹ svuotate ed àƒ¨ difficile osservare i componenti cellulari con le colorazioni utilizzate fino ad ora. La maggior parte delle pareti presentano nodositàƒÂ . Queste caratteristiche rappresentano uno stadio di sovra-maturazione della drupa. Oltre agli aspetti puramente morfo-anatomici, lࢠabilitàƒÂ  di sezionare i tessuti seminali potrebbe essere di grande importanza per eventuali analisi biomolecolari di espressione genica, come giàƒÂ  àƒ¨ stato in parte studiato recentemente (De Castro & Marraccini, 2006). Conoscere infatti gli stadi di sviluppo e i tessuti coinvolti in ciascuna fase, dàƒÂ  la possibilitàƒÂ  di evitare errori grossolani di interpretazione dei risultati e di stabilire relazioni interessanti fra la parte genetica e le osservazioni in microscopia.