Development of a gene targeting strategy (Recombinase-Mediated CAssette Exchange) to generate cellular models of MYH9-related disease

La malattia MYH9-correlata (MYH9-RD) ਠuna malattia autosomica dominante, caratterizzata da trombocitopenia congenita con piastrine di grandi dimensioni, aggregati nei neutrofili, sordità  progressiva, cataratta e nefropatia. La MYH9-RD ਠcausata da mutazioni nel gene MYH9 che codifica per la catena pesante della miosina non muscolare di classe II (miosina-9). I meccanismi patogenetici che causano questa malattia non sono ancora stati chiaramente identificati e il loro studio ਠcomplicato dalla mancanza di adeguati modelli cellulari e animali. Lo scopo di questo progetto ਠstato di generare un modello in vitro per studiare la funzione della miosina-9 e il ruolo di due mutazioni che incorrono nel gene MYH9: la R702C e la R1933X, che correlano rispettivamente con un fenotipo grave e lieve. Per questo motivo abbiamo deciso di manipolare le cellule staminali embrionali murine (ES), che sono pluripotenti e possono essere differenziate in diversi linee cellulari, compresa la linea megacariocitica. Per ingegnerizzare queste cellule ad alta efficienza abbiamo messo a punto una strategia nota come "scambio di cassette mediato da ricombinasi" (RMCE). Dopo l'integrazione di una cassetta fiancheggiata da siti FRT (sequenze di riconoscimento per l'enzima flippasi), il sistema ci ha permesso di scambiare diverse sequenze di DNA in presenza dell'enzima flippasi. Quindi il primo esone codificante del gene Myh9 ਠstato distrutto dall'inserimento, mediante ricombinazione omologa, di una cassetta fiancheggiata da due siti FRT contenente il gene reporter Beta-galattosidasi. Successivamente abbiamo scambiato questa cassetta con altre tre contenenti il cDNA Myh9 murino wild-type e i due mutati, generando i cloni ES che esprimono queste sequenze esogene sotto il controllo del promotore Myh9 endogeno. La caratterizzazione a livello dell'RNA e delle proteine di questi cloni ci ha portato a stabilire che gli alleli mutati e wild-type sono espressi allo stesso livello, suggerendo che le manipolazioni genetiche non interferiscono con i corretti meccanismi fisiologici di trascrizione e traduzione del gene Myh9. Tuttavia, mediante Western Blot abbiamo mostrato che la proteina miosina-9 ਠespressa a livello inferiore nei cloni mutati rispetto ai wild-type. Le analisi di immunofluorescenza per indagare la presenza di aggregati di miosina-9, che sono sempre presenti nei neutrofili di pazienti, non hanno rilevato alcuna variazione nella distribuzione della miosina-9, fatta eccezione per un segnale di intensità  minore. Questi risultati indicano che, nonostante l'espressione dell'allele ingegnerizzato sia normale, la proteina mutata sembra essere degradata, almeno nelle cellule ES murine, determinando un effetto di aploinsufficienza delle mutazioni R702C e R1933X. Per accertare la loro pluripotenza, abbiamo differenziato dei cloni ES in corpi embrioidi e cardiomiociti, senza rivelare alcuna differenza tra i cloni mutanti e i wild-type. Dal momento che una caratteristica congenita dei pazienti MYH9-RD ਠla macrotrombocitopenia, abbiamo sviluppato un protocollo per differenziare i cloni mutati ES in megacariociti per indagare come le mutazioni in MYH9 portino a una impropria produzione di piastrine. In conclusione, per studiare la MYH9-RD abbiamo sviluppato una strategia che ci ha permesso di esprimere sequenze di interesse in cellule ES di topo sotto il controllo del promotore Myh9 endogeno. La differenziazione in vitro di queste cellule ci permetterà  di studiare l'effetto delle mutazioni nel corso della megacariocitopoiesi. Inoltre, poichà© le cellule ES possono anche essere usate per generare modelli animali, questa strategia ci permetterà  di testare diverse ipotesi patogenetiche in vitro, prima di passare a studi in vivo.