Utilizzo di saggi ecofisiologici ed ecotossicologici per il biomonitoraggio dei metalli pesanti in aree marine portuali: micro - e macro -alghe nella bioindicazione e nel biorimedio.

RIASSUNTO Il recente Codice dell'Ambiente (D.lgs 152/2006) prevede il raggiungimento di †˜standard' di qualità  dei corpi idrici con particolare riferimento ai metalli pesanti (sostanze pericolose prioritarie, PP). Il passato piano di monitoraggio (2001-2004) del Ministero dell'Ambiente ha messo in luce il frequente superamento dei limiti di legge nelle stazioni del Golfo di Trieste. I metodi chimico/fisici utilizzati per determinare le concentrazioni di metalli in acqua o nei sedimenti non sono in grado di determinare l'effettiva biodisponibilità  degli elementi, da cui dipende la reale tossicità , nà© un preciso rapporto causa/effetto. Tuttavia, ਠrisaputo che anche basse concentrazioni possono innescare fenomeni di bioaccumulo e di biomagnificazione, alterando gli equilibri naturali soprattutto negli ambienti marini costieri. Tali processi interessano principalmente la componente macroalgale, molto importante dal punto di vista ecologico ed economico in quanto ਠalla base della catena trofica. Lo studio dell'impatto delle sostanze tossiche su questa matrice risulta, percià², fondamentale per preservare da una parte la biodiversità  degli ecosistemi dall'altra proporre sistemi alternativi/innovativi per il mantenimento della capacità  auto-depurativa. Per le alghe e per le Cianoficee, in particolare, ਠstata dimostrata un'elevata capacità  di difesa contro la tossicità  di diversi metalli attraverso vari e complessi meccanismi, le cui modalità  sono abbastanza conosciute. E' oggi noto che le risposte difensive possono dipendere dalla natura del metallo, dalle dosi e dai tempi di esposizione, dai differenti stadi di crescita, e, non ultimo, dalla diversa †˜sensibilità ' delle alghe. Tuttavia, negli studi in campo ed in laboratorio, i diversi approcci sperimentali rendono la comparazione, sia nell'ambito della stessa specie che tra specie diverse, estremamente difficile e possono portare alla determinazione di dosi subletali (LC50) molto diverse. Da qui la necessità  di un protocollo unificato che, a differenza delle micro-alghe, non ਠancora standardizzato per le macro-alghe. Tale mancanza ha comportato, infatti, risultati molto diversi senza discriminazione delle risposte adattative da quelle difensive. Inoltre, raramente vengono analizzati l'eventuale ripristino della funzionalità  cellulare durante il recupero in assenza del metallo ed i possibili effetti a livello ultrastrutturale. Scopo, percorso del progetto e metodi utilizzati Il progetto si basa principalmente sull'approfondimento delle conoscenze dei meccanismi di adattamento/tolleranza/difesa contro il Cadmio di micro- e macro-alghe marine a livello fisiologico, biochimico ed ultrastrutturale. L'obiettivo principale ਠrivolto alla possibilità  di mettere a punto un protocollo standardizzato per le macroalghe in grado di discriminare specie †˜sensibili', utilizzabili come †˜bioindicatori' nei saggi ecotossicologici, da quelle utili come bioaccumulatori. Nel corso dei tre anni il materiale bibliografico, selezionato e continuamente aggiornato, ਠstato inserito in un archivio digitale con i dati relativi alle specie algali, ai metalli, alle dosi/tempi di esposizione, ai parametri saggiati con le rispettive metodiche e alle dosi soglia di tossicità . Una parte dei lavori puಠessere consultata a video (PDF) attraverso un collegamento ipertestuale (dati non presentati). L'attività  di ricerca ਠstata suddivisa in tre parti: Parte I. Studio su micro-alghe. Sono stati approfonditi i meccanismi di adattamento/difesa ed i principali †˜siti bersaglio' a livello fisiologico ed ultrastrutturale della Cyanoficea coloniale (Leptolyngbya sp.) mantenuta in coltura. Lo studio ਠmirato soprattutto alla valutazione del metodo fluorimetrico (PAM), di nuova acquisizione nel nostro laboratorio, scelto per la minor invasività  rispetto alle altre analisi (ossimetria e pigmenti). Parte II. Studio su macro-alghe. La ricerca ਠstata condotta in tre fasi per individuare e scegliere specie sensibili/tolleranti, valutare la potenzialità  delle specie considerabili buoni †˜bioaccumulatori' e verificarne le potenzialità  d'uso come †˜biofiltri riciclabili', attraverso la stima del recupero funzionale in assenza del tossico. Parte III. Studio su macro-alghe in situ. E' stato valutato il bioaccumulo dei popolamenti presenti nella Baia di Punta Olmi (Località  †˜Boa' †" Muggia), area inquinata da metalli pesanti. Le specie macroalgali sono state prelevate in due in due siti costieri (Baia Punta Olmi †" Muggia e Porto Franco Vecchio - Trieste). Dopo la stima delle curve di saturazione i campioni sono stati adattati in cella di coltura in condizioni controllate. Al mezzo di coltura sono state aggiunte dosi di cadmio [Cd(NO3)2] e le analisi, differenziate per le diverse fasi sperimentali, sono state effettuate dopo 1-2-7 giorni di †˜stress' e dopo 7 giorni di recupero. Sono state stimate la fotosintesi (ossimetria e fluorimetria PAM), la respirazione, il contenuto di pigmenti liposolubili e condotte osservazioni al TEM. Su alcuni campioni ਠstata effettuata la microanalisi ai Raggi-X (SEM-EDS) variando la modalità  di allestimento dei preparati. Conclusioni La stima delle condizioni di coltura ed il controllo incrociato dei risultati di questa ricerca forniscono le basi per interessanti sviluppi a livello interpretativo e sembrano essere un buon punto di partenza per valutare in modo pi๠analitico le informazioni sulle possibili alterazioni del processo fotosintetico. La tecnica fluorimetrica offre, percià², indubbi vantaggi in quanto non invasiva/distruttiva, ma soprattutto in relazione al numero dei parametri disponibili. Per l'applicazione corretta del metodo fluorimetrico ਠrisultato fondamentale verificare i vantaggi ed i limiti dello strumento. L'analisi contemporanea di pi๠parametri (ecologici, fisiologici, biochimici, ultrastrutturali), con dosi e tempi fissi, dipendendo da quest'ultimi l'ampiezza della risposta, ਠun approccio valido per individuare e descrivere in maniera pi๠completa le risposte di adattamento/difesa delle alghe contro gli agenti tossici. Per quanto attiene ai tempi di esposizione, gli intervalli delle analisi (1S-2S-7S) sono risultati sufficienti per la valutazione delle risposte fisiologiche, biochimiche ed ultrastrutturali allo †˜stress', mentre i 7 giorni di recupero in assenza del metallo (7R) sono risultati sufficienti per valutare le diverse capacità  di ripresa funzionale delle specie. Le tecniche ultrastrutturali si confermano indispensabili per la localizzazione dei siti di sequestro ed accumulo del metallo, per lo studio delle modifiche cellulari, e per l'interpretazione dei risultati fisiologici. Diversamente, la microanalisi ai Raggi-X con il programma attualmente in dotazione (SEM-QUANT, ZAF), non ਠuna tecnica valida per stimare il grado di bioaccumulo in popolamenti naturali, poichà© le basse concentrazioni di metalli nei campioni biologici risultano spesso inferiori al limite di rilevabilità  del sistema. Le diverse fasi sperimentali hanno permesso di identificare le specie pi๠sensibili al cadmio, che potrebbero essere utilizzate in laboratorio come specie †˜test' nei saggi ecotossicologici e in campo come †˜biosensori'. Quelle tolleranti/resistenti sarebbero, invece, utili come bioaccumulatori. In relazione ai tempi di esposizione, alle dosi applicate e sulla base dei risultati fisiologici ed ultrastrutturali mediante i quali sono stati messi in evidenza i principali siti di accumulo, sono state individuate specie con potenzialità  diverse: a) P. pavonica, S. lomentaria, R. pseudopalmata, Z. typus e C.multifida come specie †˜sensibili'; b) R. thysanorhizans come specie †˜sensibile' di ambiente naturale; c) H. musciformis, C. fragile, D. dichotoma come specie tolleranti/resistenti; d) F. virsoides e S. scoparium come specie tolleranti/resistenti con pronto recupero della piena funzionalità  in assenza del tossico. Sono queste, quindi, le potenziali candidate da utilizzare come †˜biofiltri' nel biorimedio.