Studio della modulazione ormonale della riproduzione e della crescita nei Crostacei Decapodi mediante l'uso di neurormoni ricombinanti ed anticorpi specifici

Lࢠormone iperglicemico dei crostacei (cHH) appartiene ad una famiglia di neuropeptidi che sono prodotti e rilasciati in circolo nel complesso organo X-ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari dei crostacei. Il ruolo principale del cHH àƒ¨ quello di regolare il livello emolinfatico del glucosio, ma questo ormone àƒ¨ implicato anche nel controllo di altre funzioni come la secrezione di enzimi digestivi, la muta, la riproduzione, il metabolismo lipidico, lࢠosmoregolazione e le risposte da stress. Il cHH maturo possiede sei cisteine che formano tre ponti disolfuro, lࢠestremitàƒÂ  C-terminale ammidata e lࢠestremitàƒÂ  N-terminale bloccata dal piroglutammato come in Carcinus maenas e Jasus lalandii oppure libera come in Penaeus schmitti. Lࢠammidazione carbossiterminale àƒ¨ una modificazione post-traduttiva rilevante che fornisce attivitàƒÂ  biologica ad un grande numero di peptidi, sia nei vertebrati che negli invertebrati. Il ruolo essenziale dellࢠammidazione nel conferire unࢠattivitàƒÂ  iperglicemica al cHH àƒ¨ stato provato sinora solo per il cHH di Marsupenaeus japonicus. Per stabilire la funzione dellࢠammidazione sullࢠattivitàƒÂ  biologica del cHH in altre specie, un peptide ricombinante di 73 residui, Asl-rcHH-Gly, àƒ¨ stato espresso, foldato, purificato e trattato con lࢠenzima di ammidazione in modo da ottenere lࢠormone ammidato, Asl-rcHH-ammide. Con questo peptide ricombinante sono stati condotti dei saggi biologici su due specie appartenenti alla stessa superfamiglia (Astacoidea) ed infraordine (Astacidea) che erano Astacus leptodactylus, la specie dalla quale àƒ¨ stato clonato il cHH, e Procambarus clarkii, il cui cHH differisce da quello di A. leptodactylus per due soli amminoacidi, e su una specie filogeneticamente piàƒ¹ distante come Palaemon elegans, che appartiene ad un diverso infraordine (Caridea). Asl-rcHH-ammide ha mostrato di avere in A. leptodactylus unࢠattivitàƒÂ  iperglicemica comparabile a quella del peptide nativo estratto dalle ghiandole del seno. Raddoppiando la quantitàƒÂ  di Asl-rcHH-ammide iniettato si àƒ¨ osservata una risposta piàƒ¹ forte con una concentrazione emolinfatica di glucosio di quasi il doppio a conferma dellࢠeffetto dose dipendente dellࢠormone nellࢠindurre lࢠiperglicemia. Il profilo della curva da stimolo era differente nel caso lࢠiperglicemia fosse stata indotta da 1,7 pmol/g di peso vivo oppure da 3,3 pmol/g di peso vivo di Asl-rcHH-ammide oppure dai peptidi nativi. Il peptide ricombinante induceva un incremento massimo nella risposta dopo unࢠora, mentre lࢠestratto di ghiandole del seno induceva una risposta piàƒ¹ lenta, con un spostamento del picco di iperglicemia alle due ore. Dopo lࢠiniezione di 1,7 pmol/g di peso vivo del peptide ammidato, lࢠeffetto iperglicemico si esauriva entro le due ore dallo stimolo ed a quattro ore lࢠiperglicemia non era piàƒ¹ osservabile. Questo comportamento àƒ¨ in buon accordo con lࢠemivita di circa 10 min riportata per il cHH. Lࢠiniezione di una dose maggiore di Asl-rcHH-ammide non solo ha indotto un effetto maggiore, ma ha anche ritardato il ritorno al livello basale del glucosio, dovuto ad una insufficiente rimozione del peptide dallࢠemolinfa a causa dellࢠalta concentrazione dellࢠormone circolante. Una simile tendenza àƒ¨ stata osservata anche per lࢠestratto di ghiandole del seno che ha mantenuto un forte effetto iperglicemizzante anche a quattro ore dalla stimolazione. Il Asl-rcHH-Gly non ha mostrato una potenza comparabile. Questi risultati dimostrano chiaramente che lࢠammidazione àƒ¨ essenziale nel provvedere una completa funzionalitàƒÂ  biologica al cHH, dato che il peptide non ammidato che possiede una potenza inferiore. Infatti, per osservare un effetto iperglicemico paragonabile a quello indotto dallࢠormone ammidato, il peptide non ammidato deve essere iniettato a dosi elevate. Asl-rcHH-ammide àƒ¨ stato in grado di indurre una risposta iperglicemica anche in P. clarkii sebbene piàƒ¹ debole di quella indotta in A. leptodactylus. Il profilo temporale della risposta era simile, con un picco di massima presente ad unࢠora. Invece, lࢠiniezione di Asl-rcHH-Gly ha fornito unࢠattivitàƒÂ  iperglicemica molto debole. Per provare la capacitàƒÂ  di Asl-rcHH-ammide di indurre lࢠiperglicemia in una specie filogeneticamente piàƒ¹ distante da A. leptodactylus, àƒ¨ stato fatto un saggio eterologo sul gamberetto P. elegans. Anche in questa specie, Asl-rcHH-ammide àƒ¨ stato in grado di indurre una risposta rilevabile con un picco di glucosio presente dopo unࢠora che aveva raddoppiato il livello basale, sebbene questo effetto positivo fosse di molto inferiore a quello indotto in A. leptodactylus e P. clarkii. LࢠattivitàƒÂ  di Asl-rcHH-Gly nel gamberetto era ancora piàƒ¹ bassa se paragonata a quella del peptide ammidato. Questo dimostra che persino in specie filogeneticamente distanti lࢠattivitàƒÂ  biologica dellࢠormone viene mantenuta parzialmente, probabilmente a causa di una somiglianza strutturale nel neuropeptide. Particolarmente interessante àƒ¨ il fatto che il peptide ammidato abbia indotto risposte diverse a seconda del sesso degli animali. Nei maschi si àƒ¨ ottenuta una forte risposta iperglicemica correlata allࢠelevata quantitàƒÂ  di ormone iniettato, mentre la risposta nelle femmine àƒ¨ stata significativamente di molto inferiore. Questo dato fa supporre che nelle femmine vi fosse una diminuita affinitàƒÂ  dei recettori verso il cHH oppure che le cascate dei segnali intracellulari attivati dal legame del cHH con i recettori fossero, in qualche modo, disattivate. Anticorpi specifici anti Asl-rcHH sono stati purificati da antisiero di coniglio mediante cromatografia per affinitàƒÂ , dove il Asl-rcHH era accoppiato alla resina. Lࢠiniezione di questi anticorpi in A. leptodactylus 10 min prima dellࢠiniezione del Asl-rcHH ammidato ha fornito una risposta iperglicemica depressa, dimostrando che unࢠadeguata quantitàƒÂ  di anticorpi specifici puàƒ² essere usata per modulare lࢠasse ormonale nei gamberi. Con questo lavoro si àƒ¨ dimostrata lࢠimportanza dellࢠammidazione C-terminale per la funzionalitàƒÂ  biologica del cHH; si àƒ¨ prodotto un peptide ricombinante con unࢠattivitàƒÂ  biologica paragonabile a quella dellࢠormone nativo; si àƒ¨ evidenziato che lࢠattivitàƒÂ  del cHH dipende non solo dalla quantitàƒÂ  di ormone circolante, ma àƒ¨ anche legata alla responsivitàƒÂ  degli organi bersaglio; si àƒ¨ dimostrato che àƒ¨ possibile modulare la funzionalitàƒÂ  di un ormone mediante lࢠiniezione di anticorpi specifici. La possibilitàƒÂ  di avere a disposizione un cHH pienamente funzionante apre la strada a molteplici studi atti a comprendere meglio il ruolo di questo ormone nei processi fisiologici dei crostacei. Inoltre, àƒ¨ possibile pensare di effettuare dei trattamenti a base di peptidi ricombinanti associati ad alginati, da somministrare sotto forma di mangime, in modo da avere una modulazione esterna degli assi ormonali. La preparazione di un anticorpo specifico anti-cHH consentiràƒÂ  la messa a punto di un dosaggio ELISA da usare per monitorare le variazioni nella concentrazione emolinfatica di questo ormone legate agli stadi di crescita, riproduzione oppure dovute a fattori stressogeni.