Resistenza al linezolid e ai glicopeptidi in enterococchi isolati a Trieste

Il problema della comparsa e propagazione veloce delle antibiotico-resistenze in ambiente ospedaliero, ma anche extraospedaliero, ਠdivenuto ormai un'emergenza che solo un'attenta politica sanitaria puಠaiutare a combattere o quantomeno a contenere. Molti studi a livello nazionale e nell'ambito della comunità  europea e internazionale concordano che solo l'uso oculato dei farmaci e l'identificazione immediata delle specie resistenti possono ridurre la diffusione del fenomeno, che attualmente provoca un notevole incremento della spesa sanitaria e un peggioramento della qualità  di vita dei pazienti. I dati epidemiologici indicano una grande variabilità  geografica delle antibiotico-resistenze, sia a livello di nazioni, che di singole realtà  locali o addirittura evidenziano differenze circoscritte a piccole zone ben delimitate e questo rende praticamente impossibile estrapolare linee guida a validità  universale, mentre ਠnecessario creare programmi di sorveglianza adattati alla realtà  locale delle specie batteriche e delle loro resistenze. L'industria farmaceutica cerca di sopperire alla costante richiesta di farmaci che possono essere efficaci contro le specie resistenti, ma lo studio di nuove molecole attive richiede molti anni e spesso la loro introduzione nell'uso clinico ਠin breve neutralizzata dai meccanismi di variabilità  batterica. Il progetto di ricerca ਠpartito da una prima valutazione della situazione locale, con particolare attenzione a microrganismi che presentassero antibiotico-resistenze con frequenze anomale rispetto ai dati nazionali o internazionali e verso farmaci di recente introduzione. Si ਠosservato un dato inconsueto per la resistenza degli enterococchi al linezolid, farmaco appartenente ad una nuova classe di antibiotici, gli oxazolidinoni, il cui uso clinico ਠiniziato in Italia nel 2001. A Trieste nel 2005 si ਠregistrata una frequenza di resistenza (isolati resistenti e a sensibilità  intermedia) al linezolid in enterococchi del 5,5% che non ha riscontro nei report periodici dei programmi di sorveglianza internazionali di tale resistenza (ZAAPS, LEADER, SENTRY). Si ਠvalutata dapprima la strategia pi๠idonea per verificare se la resistenza anomala al linezolid (LNZ) fosse reale o fosse dovuta ad una sovrastima delle resistenze prodotta dalle metodologie seguite. Nel 2006 sono stati caratterizzati (identificazione con strumenti automatici o in base a caratteri fenotipici; sensibilità  ad antibatterici con metodi automatici o con test di diffusione in agar) e conservati a -80°C enterococchi isolati da tamponi rettali di sorveglianza, eseguiti regolarmente per il monitoraggio delle resistenze nei reparti ad alto rischio di infezioni (Rianimazione e reparti chirurgici), e da altri campioni afferenti al Laboratorio di Microbiologia dell'Ospedale di Cattinara, in particolare enterococchi con resistenza ai glicopeptidi o con dubbia sensibilità  al LNZ per un totale di 121 ceppi (114 isolati dai tamponi rettali di sorveglianza e 7 da materiali diversi). Sono state poi valutate le condizioni pi๠idonee per il rilevamento della mutazione G2576T, che conferisce resistenza al linezolid. Questa mutazione comporta il cambiamento di una base nel domain V della subunità  23S dell'rRNA ed ਠquella predominante in ambiente clinico. In particolare, sono stati valutati i seguenti punti: †¢ Estrazione del DNA: con fenolo/fenolo-cloroformio-isoamilico e successiva precipitazione con etanolo o, metodo pi๠veloce, trattamento a 95° per 10 minuti di una sospensione in 10 µl di acqua distillata di 2-4 colonie prelevate da una coltura on in agar sangue. †¢ Scelta dei primers per l'amplificazione della sequenza di DNA comprendente il sito di mutazione, scelta delle condizioni di amplificazione e identificazione dell'enzima di restrizione pi๠appropriato, NheI, che, in presenza della mutazione G2576T, procede al taglio del frammento di 745 bp ottenuto dall'amplificazione, generando due frammenti di 556 e 189 bp. †¢ Acquisizione di ceppi di controllo resistenti al linezolid: sono stati forniti, dalla Dott.ssa R. Fontana di Verona, 3 ceppi di Enterococcus faecium con diversi gradi di resistenza al LNZ. In nessuno dei ceppi isolati a Trieste nel 2006 ਠstata rilevata la mutazione G2576T. I ceppi di controllo, sottoposti agli stessi trattamenti di estrazione, amplificazione e restrizione, hanno invece evidenziato il profilo elettroforetico caratteristico generato dalla presenza della mutazione; ਠstata inoltre rilevata la difficoltà  di individuare la resistenza con i test di sensibilità , sia in automazione, sia in agar-diffusione, soprattutto quando solo poche copie di geni sono mutate. Nel maggio del 2007 ਠstato isolato il primo enterococco resistente ai glicopeptidi e al linezolid (E. faecalis), da un catetere di drenaggio toracico proveniente da un paziente trattato con vancomicina, ma mai con linezolid. Ciಠha dato il via ad una serie di prove per la caratterizzazione del ceppo, per la verifica della presenza della mutazione G2576T e per il controllo dell'eventuale colonizzazione intestinale attraverso colture da tamponi rettali di sorveglianza. Le prove effettuate hanno evidenziato la difficoltà , con i metodi solitamente usati in laboratorio, di isolare i ceppi resistenti in materiali con abbondante flora commensale, come sono i tamponi rettali di sorveglianza; nel materiale fecale possono infatti coabitare enterococchi resistenti e sensibili e una volta cessata la pressione selettiva, determinata dalla terapia, il ceppo sensibile prende il sopravvento su quello resistente, che sarà  cosଠdifficilmente identificabile, pur mantenendosi spesso vitale e pronto a moltiplicarsi velocemente in caso di ripresa del trattamento, annullando l'efficacia terapeutica del farmaco. Per superare il problema, ਠstata studiata una apposita strategia, basata sulla coltura dei campioni su terreno selettivo per enterococchi (Enterococcosel agar) e sul successivo inoculo su agar Mueller Hinton contenente 4 µg/ml di linezolid (Lin-screen) di una sospensione densa (2 McFarland) di colonie H2S positive prelevate dall'Enterococcosel. Tale metodo rende possibile la selezione diretta di enterococchi LNZ-resistenti dai tamponi rettali. La sua applicazione ha consentito sia l'isolamento di E. faecalis LNZ-resistente dal tampone rettale del paziente da cui era stato isolato il primo enterococco resistente al linezolid, sia il ritrovamento di un secondo ceppo resistente ai glicopeptidi e al linezolid (E. faecium) in un campione fecale di un paziente in precedenza trattato con linezolid, ma mai sottoposto a terapia con vancomicina. Lo studio si ਠquindi focalizzato sui ceppi resistenti al linezolid isolati a Trieste, con la ricerca da un lato della storia clinica dei pazienti da cui i ceppi erano stati isolati, dall'altro con la conferma molecolare della presenza della mutazione G2576T e con la genotipizzazione dei ceppi resistenti e sensibili isolati dagli stessi pazienti. àˆ stato inoltre valutata la frequenza della resistenza ai glicopeptidi nel triennio 2006-2008. I principali risultati ottenuti includono: 1) La dimostrazione che il sistema automatico Vitek tende a sovrastimare la resistenza al Linezolid: 9 ceppi di enterococco, la cui MIC per linezolid, determinata dal sistema automatico Vitek, era di 4 µg/ml, indice di sensibilità  intermedia (I), sono stati saggiati con Lin-screen e con E-test: non ਠstata rilevata crescita e la MIC ਠrisultata nel range di sensibilità  dimostrando cosଠche il 5,5% di resistenza (ceppi a sensibilità  intermedia o resistenti) al linezolid rilevato nel 2005 era quasi certamente frutto di una sovrastima del Vitek. 2) La descrizione del primo caso in Italia di colonizzazione con E. faecalis resistente sia al linezolid che alla vancomicina: il ceppo ਠstato isolato da un catetere di drenaggio toracico da un paziente trattato con vancomicina per empiema pleurico causato da S. aureus meticillino-resistente (MRSA).