Sviluppo di un bioindicatore naturale per il monitoraggio della qualità delle acque

La concentrazione del glucosio emolinfatico ਠregolata nei Crostacei dal crustacean Hyperglycemic Hormone (cHH), un neuropeptide prodotto e rilasciato in circolo nel complesso organo X-ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari. Il cHH, oltre a essere coinvolto nella regolazione di diversi processi fisiologici, ਠimplicato anche nelle risposte da stress di origine ambientale o dovute all'esposizione a xenobiotici, il cui risultato finale ਠun aumento della glicemia. In numerose specie di crostacei sono state identificate pi๠forme circolanti del cHH, alcune delle quali derivano da geni diversi e si differenziano per la sequenza amminoacidica, altre invece risultano da processi di maturazione post-traduzionale dei peptidi come l'isomerizzazione della L-Phe3 con la conseguente formazione di D-Phe3. Le eventuali differenze nella funzione biologica di queste due isoforme chirali sono ancora poco chiare, ma gli scarsi studi sin qui condotti indicano che il D-cHH ha una maggiore e pi๠prolungata attività  iperglicemizzante. Inoltre, ਠstato proposto un suo coinvolgimento sia nell'inibizione della sintesi degli ecdisteroidi sia nella regolazione osmotica. Due sono stati gli indirizzi principali di ricerca sviluppati in questi anni di dottorato. Il primo ਠconsistito nel gettare le basi per la realizzazione di un organismo bioindicatore capace di rilevare la presenza di sostanze tossiche cambiando la propria colorazione in modo facilmente visualizzabile, ed ਠstato completato con il clonaggio e l'identificazione del promotore del cHH di Astacus leptodactylus (Crustacea, Decapoda), la verifica in vitro della sua funzionalità  e l'identificazione di possibili siti di legame per dei fattori di trascrizione. L'obiettivo finale ਠla modifica in via transiente di Palaemon elegans e Palaemonetes antennarius (Crustacea, Decapoda) mediante l'iniezione di emociti trasfettati con il plasmide veicolante il promotore del cHH ed un gene reporter che visualizza la risposta mediante colorazione dell'animale. Il secondo progetto ha riguardato la sintesi chimica di alcune forme chirali del cHH di A. leptodactylus che ਠl'unica strategia possibile per ottenere peptidi identici all'ormone nativo, essendo la sola capace di consentire l'introduzione di tutte le modificazioni post-traduzionali necessarie. I peptidi ottenuti sono stati quindi adoperati in saggi biologici in vivo per provare la loro funzionalità . Inoltre, ਠstato fatto uno studio per appurare il possibile ruolo del cHH nel controllo dell'aggressività  in Procambarus clarkii (Crustacea, Decapoda). Per ottenere una quantità  sufficiente delle forme chirali del cHH in modo da poterne studiare la funzione biologica, abbiamo scelto la strada della sintesi chimica in fase solida (SPPS). La SPPS ਠgeneralmente limitata alla sintesi di peptidi non pi๠lunghi di 40 amminoacidi. Per ottenere sequenze pi๠lunghe ਠnecessario sintetizzare segmenti diversi e quindi ligarli assieme attraverso delle reazioni chimiche. In questo caso si ਠadoperata la native chemical ligation. Il primo passo ha riguardato la sintesi di sei segmenti (QVF-cHH4-38, QVdF-cHH4-38, pEVF-cHH4-38, pEVdF-cHH4-38, pEVdA-cHH4-38, cHH-39-72) che legati fra loro in maniera diversa avrebbero portato alla formazione di cinque peptidi ammidati al C-terminale, due con la L-Phe3 e la parte N-terminale libera oppure bloccata con il piroglutammato, due con la D-Phe3 e la parte N-terminale anch'essa libera oppure bloccata, e uno con la D-Phe3 sostituita dalla D-Ala3 e l'N-terminale bloccato dal piroglutammato. La sintesi dei diversi segmenti non ha dato particolari problemi, ma la purificazione del segmento cHH-39-72 ਠrisultata particolarmente difficile, in quanto questo peptide ਠrisultato essere molto poco solubile. Questo problema ਠstato risolto con l'aggiunta di gruppi †"SO3 allo zolfo delle cisteine che ha reso solubile il segmento cHH-39-72. Sono stati quindi sintetizzati in quantità  sufficienti, dell'ordine di un centinaio di microgrammi, le seguenti forme chirali del cHH: QVdF-cHH, QVF-cHH, pEVF-cHH, pEVdF-CHH e pEVdA-cHH. In quest'ultima isoforma la D-fenilalanina in posizione 3 ਠstata sostituita dalla D-alanina, per verificare se la fenilalanina avesse un ruolo fondamentale nella funzionalità  del peptide. I peptidi di sintesi sono stati quindi utilizzati per eseguire dei saggi in vivo su A. leptodactylus, iniettando nei gamberi il cHH sintetico e verificando la risposta biologica indotta attraverso il dosaggio della glicemia. I prelievi per il dosaggio del glucosio sono stati fatti ai tempi 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h. Il profilo temporale della risposta glicemica indotta dalle due forme chirali ਠdiverso, con il L-cHH avente un picco di risposta tra le 2 h e le 4 h, mentre il picco massimo della risposta del D-cHH ਠpi๠tardivo, situandosi tra le 4 h e le 8 h. Invece, la differenza nella risposta iperglicemica tra la forma bloccata all'N-terminale (Glp-D-cHH) e la forma non bloccata (D-cHH) non ਠstata significativa a dimostrazione che la presenza del piroglutammato non influenza la risposta biologica indotta dal cHH. L'attività  biologica dell'isomero Glp-dA-cHH ਠstata verificata usando il medesimo protocollo. L'attività  iperglicemizzante di questo peptide ਠrisultata essere significativamente inferiore a quella indotta dal Glp-D-cHH. Il risultato ottenuto dimostra che la porzione N-terminale del cHH ਠfondamentale per la funzionalità  del peptide. Lo studio del promotore del cHH ਠstato effettuato su una sequenza clonata di 176 nucleotidi a monte della regione 5' del gene per il cHH di A. leptodactylus, che ਠstata inserita in un vettore senza promotore (pGL3-Basic) a monte del gene reporter per la luciferasi. Con questo vettore sono state trasfettate cellule HEK 293T e la funzionalità  del promotore ਠstata dimostrata da un incremento di circa 1000 volte nell'espressione della luciferasi rispetto a pGL3-Basic. La ricerca di eventuali siti di legame per elementi di regolazione presenti nella sequenza clonata ha consentito di identificare numerosi possibili siti di legame, inclusi una TATA box a -23, una CCAAT box a -78, due GC box a -63 e -70, ed altri per specifici elementi di trascrizione, pi๠precisamente una sequenza a -91 dove i siti di legame per il cAMP response element-binding (CREB), l'elemento di risposta all'ipossia (HRE), il recettore per l'estrogeno (ER-alpha) si sovrappongono, mentre a -160 ਠstato identificato un possibile sito di legame per il recettore dell'ecdisone (EcR). L'influenza del cHH sull'aggressività  in P. clarkii ਠstata studiata iniettando negli animali il cHH nativo estratto dalle ghiandole del seno. In generale gli animali in cui era stato iniettato il cHH hanno mostrato un aumento nell'espressione della dominanza, gli alfa attraverso un aumento della durata dei combattimenti e i beta per la maggiore intensità  dei combattimenti che ne aumentava la dominanza fino a raggiungere una temporanea inversione della gerarchia. Il potenziamento del comportamento aggressivo potrebbe essere dovuto o a una modulazione da parte del cHH dei neuroni che controllano l'espressione del comportamento agonistico, oppure essere dovuto a una maggiore mobilizzazione delle risorse energetiche necessarie per la lotta. Per la prima volta sono state ottenute diverse isoforme del cHH mediante la sintesi peptidica in fase solida accoppiata alla native chemical ligation. I dati ottenuti indicano che questa ਠla strategia appropriata per la sintesi dei peptidi della famiglia del cHH, essendo l'unica in grado di consentire l'introduzione di tutte le modifiche post-traduzionali per ottenere un peptide identico all'ormone nativo. L'ottimizzazione del presente protocollo consente di rendere disponibili adeguate quantità  di peptidi per esperimenti su larga scala, in vivo e in vitro, che possono portare a una migliore conoscenza della funzione del cHH e della relazione tra funzione e struttura. Inoltre sono state gettate le basi per la realizzazione di un organismo bioindicatore per monitorare l'inquinamento delle acque.