Feasibility Study on detection and monitoring of gene-mutations by digital (dPCR) NGS driven in patients with Acute Myeloid Leukemias (AMLs) and High-Risk Myelodysplastic Syndromes (HR-MDSs)- “dPCR-NGS Driven Study”

Acute Myeloid Leukemia (AML) is a hematologic malignancy characterized by significant biological, clinical, and prognostic heterogeneity. Although current induction and consolidation therapies achieve complete remission in 60–80% of cases, long-term survival remains limited due to the high risk of relapse, often making allogeneic hematopoietic stem cell transplantation necessary. Prognostic stratification at diagnosis is based on cytogenetic and molecular analyses, and more recently on Next Generation Sequencing (NGS), combined with the assessment and monitoring of measurable residual disease (MRD). The introduction of NGS has highlighted the high clonal heterogeneity of AML, overcoming the sensitivity limitations of cytogenetics (up to 10-²) and RT-qPCR, the latter being more sensitive (up to 10-⁵) but limited to a few clonal disease markers (FLT3, NPM1, IDH1, IDH2). However, the sensitivity of commercially available NGS panels is still insufficient for MRD monitoring. Likewise, although immunophenotypic analysis is sensitive, it is affected by variability, which limits its reliability in detecting leukemic clones. This thesis aims to evaluate an innovative strategy combining NGS and digital PCR (dPCR), a highly sensitive technique (up to 10-⁵–10-⁶), to identify, quantify, and longitudinally monitor clonal mutations. At diagnosis, both bone marrow and peripheral blood samples were collected from patients eligible for intensive therapy. NGS analysis (myeloid panel by SOPHiA Genetics) was performed to identify mutations, which were then quantified and monitored using dPCR at various time points (post-induction/consolidation, end of treatment, pre/post-transplant, and at relapse). For mutations without commercial probes, customized assays (Custom TaqMan assays) were developed. Furthermore, the multiplex approach on the QuantStudio™ Absolute Q™ system enabled simultaneous analysis of multiple mutations with high efficiency and accuracy. Feasibility was defined as the ability to monitor at least 70% of patients using dPCR. Preliminary results confirm the feasibility of this NGS-driven dPCR approach for MRD monitoring. In fact, 86% of patients (12 out of 14) had at least one mutation identified at diagnosis via NGS that was subsequently successfully monitored with dPCR. Most of the probes (14 out of 18; 78%) were custom-designed and patient-specific. However, it is worth noting that the initially high percentage of custom-designed probes may decrease over time, as validated probes become available for future patients. All selected mutations were detectable in both bone marrow and peripheral blood, suggesting that, in the future, MRD monitoring could potentially be performed using only peripheral blood samples. Compared to conventional MRD assessment techniques, the data supports two possible scenarios: (i) MRD monitoring in the absence of traditional markers, and (ii) MRD monitoring in their presence. In the latter, the combined approach not only confirmed results from traditional marker analysis but also enabled earlier detection of molecular clearance and, in some cases, early identification or prediction of relapse. In conclusion, the NGS-driven dPCR approach has proven feasible and effective for identifying, quantifying, and monitoring disease-associated mutations, representing an advanced tool for MRD assessment and more precise and personalized management of patients with AML.

La Leucemia Acuta Mieloide (LAM) è una neoplasia ematologica caratterizzata da elevata eterogeneità biologica, clinica e prognostica. Sebbene le attuali terapie di induzione e consolidamento portino alla remissione completa nel 60–80% dei casi, la sopravvivenza a lungo termine resta limitata per l’elevato rischio di recidiva, rendendo spesso necessario il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche. La stratificazione prognostica alla diagnosi si basa sull’analisi citogenetica, molecolare e, più recentemente, sul Next Generation Sequencing (NGS), unitamente alla determinazione e al monitoraggio della malattia residua misurabile (MRM). L’introduzione dell’NGS ha permesso di evidenziare l’elevata eterogeneità clonale della malattia, superando i limiti di sensibilità della citogenetica (fino a 10-²) e della RT-qPCR, quest’ultima più sensibile (fino a 10-⁵) ma limitata a pochi marcatori clonali di malattia (FLT3, NPM1, IDH1, IDH2). Tuttavia, la sensibilità dei pannelli NGS commerciali resta insufficiente per il monitoraggio della MRM. Anche l’analisi dell’immunofenotipo, seppur sensibile, soffre di variabilità nella definizione dei cloni. Questa tesi si propone di valutare una strategia che combina analisi di NGS e PCR digitale (dPCR), tecnica altamente sensibile (fino a 10-⁵-10-⁶), per identificare, quantificare e monitorare nel tempo le mutazioni clonali. A partire dalla diagnosi, sono stati raccolti campioni di sangue midollare e periferico di pazienti candidati a terapia intensiva. Successivamente è stata eseguita l’analisi NGS (pannello mieloide SOPHiA Genetics) permettendo così l'identificazione di mutazioni e, quindi, la quantificazione ed il monitoraggio mediante dPCR, anche in follow-up (post-induzione/consolidamento, fine terapia, pre/post-trapianto ed in caso di recidiva). Per mutazioni prive di sonde commerciali, sono stati sviluppati saggi personalizzati (Custom TaqMan assays). Inoltre, l’approccio multiplex su sistema QuantStudio™ Absolute Q™ ha permesso l’analisi simultanea di più mutazioni, con elevata efficienza e accuratezza. La fattibilità dello studio è stata definita come la possibilità di monitorare almeno il 70% dei pazienti mediante dPCR. I risultati preliminari confermano la fattibilità di questo approccio per il monitoraggio dell’MRM. Infatti, l’86% dei pazienti (12 su 14) presentava almeno una mutazione identificata mediante NGS alla diagnosi, la quale è stata successivamente monitorata con successo tramite dPCR. La maggior parte delle sonde (14/18; 78%) sono state customizzate, risultando paziente specifiche. Tuttavia, è importante sottolineare che l’iniziale alta percentuale di sonde custom-designed, potrebbe progressivamente ridursi, avendo a disposizione probes già disegnate per i pazienti analizzati. Inoltre, tutte le mutazioni selezionate sono state rilevate sia nel sangue midollare che nel sangue periferico. Questo dato, in futuro, potrebbe suggerire la possibilità di monitorare la MRM utilizzando esclusivamente campioni di sangue periferico. Rispetto alla valutazione della MRM con metodiche tradizionali, i dati ottenuti evidenziano due possibili scenari: (i) monitoraggio della MRM in assenza di marker tradizionali, e (ii) monitoraggio della MRM in presenza di marker tradizionali. In quest’ultimo caso, l’approccio combinato basato su dPCR ed NGS ha permesso non solo di confermare i risultati ottenuti tramite l’analisi dei marker tradizionali, ma anche di anticipare la clearance molecolare e, in alcuni casi, di rilevare precocemente o prevedere la recidiva di malattia. In conclusione, questo approccio si è dimostrato fattibile ed efficace per identificare, quantificare e monitorare le mutazioni associate alla malattia, rappresentando uno strumento avanzato per la valutazione della MRM e per una gestione più precisa e personalizzata dei pazienti affetti da LAM.