Doppia funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle: nuovi approcci per il targeting del beta-amiloide.

Il lavoro di tesi si ਠincentrato sulla formulazione di nanoparticelle (Nps)bifunzionalizzate in superficie con due diversi ligandi:il primo avente come target il cervello,il secondo mirato al beta-amiloide,un peptide coinvolto nel processo di malattia di Alzheimer (AD). AD ਠuna patologia caratterizzata da progressiva neurodegenerazione, la cui eziologia ਠancora incerta.L'ipotesi di patogenesi pi๠accreditata si basa su'alterazione del metabolismo di una proteina,APP(proteina pecursore di beta amiloide).Questa genera peptidi insolubili (Abeta 1-40,Abeta 1-42) che lentamente si accumulano nel cervello (ippocampo,amigdala e aree corticali), formando aggregati e placche responsabili dell'attivazione di processi infiammatori e danno neuronale. Ad oggi non esiste un trattamento atto alla rimozione della causa di AD.Ciಠਠdovuto alla difficoltà  degli attivi di superare la barriera ematoencefalica (BEE),una struttura anatomica interposta fra sangue e parenchima nervoso, che regola selettivamente il passaggio sanguigno di sostanze da e verso il cervello. Le ricerche sviluppate negli ultimi anni dal gruppo di tecnologia farmaceutica dell'Università  degli Studi di Modena e Reggio Emilia diretto dalla prof.Vandelli, hanno portato alla messa a punto di Nps capaci di superare la BEE grazie all'ingegnerizzazione superficiale con un eptapeptide denominato g7.L'utilizzo di tale ligando ha permesso di creare dei vettori in grado di raggiungere il target cerebrale, e con area superficiale ancora libera e disponibile per ulteriori modifiche. Durante il lavoro di tesi sono state formulate g7-Nps tramite emulsione semplice,successivamente coniugate (previa attivazione delle terminazioni carbossiliche di g7-Nps con tecnica EDC/NHS) con due diversi tipi di ligandi.Tali ligandi, un peptide (KLVFF) e un anticorpo monoclonale (Mab[13-28]),sono stati scelti per le loro capacità  di riconoscere specificatamente peptidi amiloidogenici e di rallentare o arrestare il processo di aggregazione;presentano tuttavia scarsa efficacia in vivo data la ridotta capacità  di penetrazione della BEE. Le Nps bi-ingegnerizzate, sono state dapprima sottoposte a caratterizzazione chimico-fisica per valutare distribuzione dimensionale,indice di polidispersione e morfologia,e successivamente a caratterizzazione tecnologica per valutare resa ponderale,composizione (presenza di tensioattivo residuo) ed efficienza di derivatizzazione.Successivamente sono stati condotti saggi di attività  confrontando uguali concentrazioni di ligandi liberi e coniugati a g7-Nps e valutandone l'attività  antiaggregante:dal punto di vista quantitativo mediante saggi ex vitro (aggregazione su piastra di Abeta 1-42 tramite saggio di fluorescenza con tioflavina (ThT))dopo opportuna validazione del metodo;dal punto di vista morfologico tramite microscopia AFM.Le Nps bifunzionalizzate hanno dimostrato capacità  di stabilizzare il ligando (efficienze elevate di coniugazione prossime al 60%) conservandone la specifica attività  antiaggregante verso beta-amiloide.Tale lavoro di tesi,con la validazione di un metodo ex vitro per testare l'azione e la potenzialità  di attivi che spesso necessitano di stabilità  e di un vettore,rappresenta il primo approccio per arrivare a una terapia mirata ed efficace nell'AD.Dalle prove effettuate sembra addirittura che i ligandi diretti verso beta-amiloide, ancorati sulla superficie di g7-Nps,vedano migliorata l'azione di inibizione dell'aggregazione.Il peptide Abeta,bloccato per interazione specifica con il ligando coniugato alle Nps,risulta in buona parte impedito nel suo normale processo di aggregazione.Si puಠquindi ipotizzare che le Nps funzionino da vere e proprie spugne capaci di bloccare stabilmente i frammenti,impedendo loro la riorganizzazione ed aggregazione.Tale ipotesi dovrà  essere confermata con ulteriori studi in vitro ed in vivo.