La resistenza agli acidi organici deboli: carattere di selezione di lieviti di interesse enologico

La selezione di lieviti da impiegare come colture starter per la produzione dei vini spumanti e frizzanti, si basa su alcuni caratteri fondamentali tra i quali, in particolare, la resistenza alle basse temperature di rifermentazione e alle alte concentrazioni di anidride carbonica. Diversi lavori scientifici hanno descritto alcuni possibili ripercussioni delle elevate concentrazioni di CO2 sulle cellule di lievito, tra cui la perdita di biomassa e della capacità  fermentativa nonchà© l'inibizione della divisione cellulare. Durante la fase di rifermentazione dei vini spumanti, tali effetti possono essere la causa di arresto del processo fermentativo con gravi conseguenze sul prodotto finale. In questo studio, si ਠinteso selezionare dei ceppi di lievito capaci di resistere ad elevate concentrazioni di acidi organici deboli, la cui azione sulle cellule di lievito fosse simile a quella esercitata dall'acido carbonico. In particolare, sono stati presi in considerazione gli acidi monocarbossilici acetico, benzoico e sorbico, i quali sono normalmente impiegati in ambito alimentare. Questi acidi organici deboli permeano la membrana plasmatica della cellula di lievito nella loro forma indissociata e all'interno della cellula, dato i valori di pH del citosol, dissociano nelle loro forme ioniche. L'anione carbossilico si accumula nella cellula dato che la membrana plasmatica ਠad esso impermeabile, mentre il catione H+ innesca l'attività  dell'ATPasi che espelle il catione al costo di un grande dispendio energetico. Il presente lavoro di tesi ਠstato svolto presso il gruppo di ricerca della UNIMORE Microbial Colture Collection (UMCC) e sono stati usati ceppi di Saccharomyces cerevisiae appartenenti alla collezione. Lo scopo di questa tesi ਠstata la messa a punto di un protocollo di screening utile a discriminare lieviti resistenti ad alte concentrazioni di acidi organici deboli. Successivamente, alcuni dei ceppi precedentemente testati sono stati impiegati per applicare una strategia di evoluzione adattativa basata sulla ricombinazione sessuale casuale delle spore e sulla successiva applicazione di una pressione selettiva, consistente, nello specifico, all'aggiunta di acido sorbico alla concentrazione utile a discriminare i ceppi resistenti. In particolare, la strategia applicata a 3 ceppi parentali, UMCC 856, UMCC 943 e UMCC 845 ha permesso la selezione di 3 nuovi ceppi evoluti, codificati come RS1-1, RS1-8, RS1-9 che hanno dimostrato essere maggiormente resistenti nel terreno selettivo liquido addizionato con acido sorbico rispetto ai relativi ceppi parentali. Al fine di confrontare i profili genetici dei ceppi evoluti con quelli dei rispettivi parentali, e stata utilizzata la tecnica di “DNA fingerprinting Repetitive Extragenic Palindromic-PCR” impiegando due diversi primer oligonucleotidici: 5'-GACAGACAGACAGACA-3' (GACA)4 e 5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3' (GTG)5. I risultati hanno confermato l'effettiva diversità  tra i profili elettroforetici dei ceppi indagati confermando l'assenza di ridondanze e la selezione di ceppi evoluti geneticamente differenti dai ceppi parentali. Infine, i ceppi evoluti e i loro parentali sono stati nuovamente testati in piastre contenenti il terreno selettivo con l'inclusione delle concentrazioni discriminanti di ciascun acido, confermando la maggior resistenza dei nuovi ceppi ottenuti. In definitiva, grazie alle prove sperimentali effettuate nel presente studio, ਠstato possibile standardizzare un protocollo di screening di resistenza agli acidi organici deboli testati, individuando le concentrazioni di acido inibenti la vitalità  dei lieviti esaminati e le concentrazioni utili a discriminare i ceppi sensibili da quelli resistenti. Inoltre, sono stati selezionati nuovi ceppi di potenziale interesse enologico e con le caratteristiche desiderate, validando l'efficacia della strategia evolutiva di miglioramento genetico applicata.