CARATTERIZZAZIONE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DEL DNA LIBERO CIRCOLANTE NEL PLASMA SEMINALE ALLO SCOPO DI IDENTIFICARE NUOVI BIOMARCATORI DISCRIMINANTI TRA CANCRO PROSTATICO E IPERPLASIA PROSTATICA BENIGNA

Il DNA libero circolante (cfDNA) ਠcostituito da frammenti di DNA genomico che viene rilasciato dalle cellule con meccanismi principalmente di apoptosi e necrosi. Negli individui sani la sorgente principale di cfDNA ਠl'apoptosi che causa il rilascio principalmente di frammenti multipli di 166 bp mentre nei pazienti affetti da neoplasia l'evento pi๠frequente ਠla necrosi che causa una digestione casuale e incompleta del DNA generando frammenti di lunghezza variabile. Ad oggi, il cfDNA viene estratto essenzialmente dal sangue (plasma o siero), tuttavia, possono essere utilizzati anche altri fluidi biologici che presentano maggiore specificità  d'organo e nei quali puಠesservi una maggiore concentrazione di cfDNA se confrontata con quella misurata nel sangue. Per le neoplasie prostatiche, ਠnoto che a parte l'antigene prostatico specifico (PSA), non esistono altri marcatori sensibili e specifici, cosଠcome che il livello di cfDNA plasmatico ਠmolto basso rispetto a quello di altre neoplasie (polmone, colon): la sua estrazione dal liquido seminale puಠpresentare dei potenziali vantaggi nell'identificazione di un marcatore diagnostico e/o prognostico. In questa tesi sono presentate due parti di uno studio inerente il ruolo del cfDNA quale marcatore di neoplasia prostatica. Una prima parte della ricerca ਠstata condotta sul plasma sanguigno: sono stati arruolati 47 individui, dei quali 32 con diagnosi istologica di cancro prostatico (CP) e 15 sani quale popolazione di controllo. L'estrazione del cfDNA dal plasma, ottenuto in seguito a due cicli di centrifugazione, ਠstata effettuata utilizzando il kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen). Il cfDNA estratto ਠstato quantificato utilizzando tre metodiche basate rispettivamente sulla spettrofotometria (Nanodrop), fluorimetria (Qubit utilizzando il kit per quantificare il DNA a singolo filamento e il DNA a doppio filamento) e qPCR (gene APP). Il saggio mediante Qubit ssDNA si ਠmostrato un metodo sensibile per la quantificazione del cfDNA totale. La seconda parte della ricerca ਠstata condotta sul liquido seminale per quantificare e caratterizzare la presenza di cfDNA in 30 pazienti con cancro alla prostata, 33 pazienti con iperplasia prostatica benigna (IPB) e 21 soggetti sani. L'estrazione del cfDNA dal plasma seminale, ottenuto in seguito a due cicli di centrifugazione, ਠstata condotta utilizzando il kit QIAmp Circulating Nucleic Acid e la quantificazione tramite il Qubit con saggio per ssDNA. La frammentazione del DNA circolante ਠstata analizzata utilizzando la tecnica di elettroforesi automatizzata mediante Bioanalyzer 2100 (Agilent). La concentrazione media del cfDNA nel plasma seminale (863,32 ± 1130,38 ng/mL) si ਠmostrata notevolmente pi๠alta rispetto a quella presente nel plasma sanguigno (20,38 ± 12,02 ng/mL) dei pazienti con cancro alla prostata e significativamente differente da quella dei pazienti con IPB (404,49 ± 671,45 ng/mL) e dei soggetti sani (49,40 ± 53,45 ng/mL). L'analisi della frammentazione del DNA nei pazienti con CP ha mostrato una differenza significativa circa la presenza di frammenti ad alto peso molecolare rispetto a pazienti con IPB e ai controlli. Questa ricerca ha evidenziato che la quantificazione e qualificazione del cfDNA totale ha una correlazione diretta con quello tumorale e puಠessere utilizzato quale biomarcatore per la neoplasia della prostata sia quando estratto dal sangue che dal liquido seminale. In quest'ultimo caso la concentrazione risulta molto pi๠elevata e con uno specifico pattern di frammentazione che permette di ritenere questo fluido biologico potenzialmente utile anche per la diagnosi differenziale tra CP e IPB.