Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMO): una nuova classe di enzimi attivi sulle biomasse recalcitranti. Produzione, caratterizzazione e confronto tra due proteine appartenenti a questa superfamiglia.

Le Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) sono metallo-proteine di recente scoperta, trovate in batteri, funghi e artropodi, capaci di degradare attraverso un meccanismo ossidativo polisaccaridi recalcitranti, come ad esempio chitina e cellulosa. L'importanza delle LPMOs nei processi industriali di bioraffineria ਠdimostrata dalla loro recente inclusione nei cosiddetti "cocktail enzimatici" utilizzati per la degradazione delle biomasse lignocellulosiche. Nonostante l'intenso studio negli ultimi anni di tali sistemi, molti aspetti riguardanti la (bio)chimica e il meccanismo d'azione delle LPMOs rimangono ambigui e necessitano di ulteriore delucidazione. Inoltre, la recente scoperta di LPMOs di differenti origini e peculiari caratteristiche dimostra che questa superfamiglia di metallo-enzimi ਠin continua espansione e che la nostra conoscenza al riguardo ਠancora limitata. In quest'ottica diventa essenziale lo sviluppo di protocolli rapidi ed efficaci per l'identificazione, la produzione e la caratterizzazione delle LPMOs. Una delle principali difficoltà  che si riscontrano durante la produzione ricombinante di una LPMO ਠdata dalla necessità  di ottenere la forma attiva della proteina, contenente un'istidina libera come residuo N-terminale. In questo lavoro, la proteina AoAA11 di origine fungina ਠstata prodotta seguendo un protocollo consolidato, basato sulla purificazione dallo spazio periplasmatico di E.coli. Diversamente, la proteina PpAA10, derivante dal batterio gram-negativo Pseudomonas putida, ਠstata prodotta per via ricombinante e purificata per la prima volta, seguendo una strategia basata sull'utilizzo di un clonaggio indipendente dalla ligation, accoppiato al trattamento del prodotto di espressione con una specifica proteasi chiamata WelQut®, per rimuovere gli amminoacidi indesiderati presenti all'N-terminale. Saggi di SDS-PAGE e l'analisi con spettrometria di massa hanno confermato il successo di questa procedura. La seconda parte del progetto ha riguardato invece la caratterizzazione e il confronto tra le due proteine prodotte, attraverso lo studio di proprietà  biochimiche, spettroscopiche e elettrochimiche. L'analisi con spettrometria MALDI-TOF ha dimostrato che entrambi gli enzimi sono attivi sulla chitina e producono oligosaccaridi solubili con ossidazione in posizione C1. Inoltre, in assenza di una struttura cristallografica, la struttura del sito attivo di PpAA10 ਠstata indagata mediante spettroscopia EPR, rivelando un centro metallico classificato come "type II copper center", con una geometria di coordinazione altamente dipendente dal pH. A bassi valori di pH, la geometria del sito attivo e' in accordo con quanto riportato in letteratura per altre AA10s. Infine, ਠstata condotta una stima dei potenziali standard di ossidoriduzione delle coppie AoAA11-Cu2+/Cu1+ e PpAA10-Cu2+/Cu1+, per ottenere informazioni preliminari sul meccanismo di trasferimento elettronico di questi enzimi.