Ruolo dello splicing alternativo e della fosforilazione di MEF2C nella proliferazione e nel differenziamento dei mioblasti.

Tra i membri della famiglia di proteine MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), MEF2C esercita un ruolo rilevante nella miogenesi cardiaca e scheletrica. Nel nostro laboratorio ਠstato dimostrato che oltre alla sua importanza per il differenziamento terminale del muscolo, MEF2C ਠcoinvolto anche nella progressione del ciclo cellulare e nella proliferazione. Questo fattore di trascrizione subisce infatti uno splicing alternativo e le due varianti di splicing contenenti i due esoni mutualmente esclusivi α1 e α2 influenzano in maniera differente la proliferazione e il differenziamento terminale dei progenitori muscolari. In particolare, l'isoforma α2 ਠper lo pi๠espressa nei mioblasti differenziati, mentre l'isoforma α1, che presenta i due siti accettori del gruppo fosfato Ser98 e Ser110, stimola la proliferazione dei mioblasti ed induce l'ipertrofia del muscolo scheletrico, mediata dalla pathway PI3K-AKT-S6K. à‰ stato osservato come anche in linee cellulari di Rhabdomyosarcoma, tumore pediatrico caratterizzato da cellule che continuano a replicarsi con un conseguente inefficiente differenziamento muscolare terminale, vi sia una maggiore espressione dell'isoforma α1. I nostri dati indicano che MEF2Cα1 promuove la proliferazione delle cellule di RMS, reprime il differenziamento terminale ed attiva la pathway PI3K-AKT-S6K. Tuttavia, sembrerebbe che uno splicing alternativo aberrante non sia l'unico meccanismo responsible dell'inefficiente attività  pro-miogenica di MEF2Cα1 nei mioblasti proliferanti. Ad esempio, i già  menzionati siti accettori del gruppo fosfato sono siti di legame di PIN1, peptidil prolil cis-trans isomerasi che agisce come repressore del differenziamento muscolare. Durante il mio lavoro di tesi abbiamo isolato quattro cloni della linea cellulare C2C12 che over esprimono MEF2Cα1, MEF2Cα2, MEF2Cα1 mutante nei due siti accettori del gruppo fosfato (2SA) e, come controllo, una linea clonale trasfettata con il vettore vuoto (RFP). Successivamente abbiamo investigato i cambiamenti fenotipici, inclusi il potenziale proliferativo e differenziativo, connessi alle modifiche post trascrizionali (splicing) e post traduzionali (fosforilazione). Abbiamo inoltre analizzato come le differenti isoforme di MEF2C e il loro stato di fosforilazione esercitino un diverso effetto sull'attivazione della pathway PI3K-AKT-S6K. Ciಠche ਠemerso ਠche l'over espressione di MEF2Cα1 e del mutante non fosforilabile 2SA sono in ugual modo in grado di stimolare la pathway PI3K-AKT-S6K sia nelle C2C12 che nelle cellule di RMS, MEF2Cα2, invece, non stimola questa pathway. Inoltre, se nelle C2C12 MEF2Cα1 non reprime il differenziamento terminale ma, al contrario, lo promuove, nelle cellule di RMS ਠin grado di reprimerlo, mentre il mutante 2SA ਠin grado di stimolarlo, suggerendo come la fosforilazione giochi un ruolo fondamentale nel differenziamento muscolare. Infatti, abbiamo notato che differentemente da quanto accade per le C2C12, nelle cellule di RMS la fosforilazione di MEF2Cα1 viene mantenuta anche dopo l'induzione del differenziamento muscolare e ciಠpotrebbe essere la causa della mancata uscita dal ciclo cellulare.