Purification and Characterization of LPMOs (Lytic Polysaccharide Monooxygenases)

Le Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) sono una classe di metallo-enzimi, di origine fungine fungina, ma anche batterica, virale e animale (artropodi). Tali enzimi operano in sinergia con altri enzimi idrolitici, i quali agendoiscono su sostanze recalcitranti come, ad esempio, cellulosa e chitina. Le LPMO presentano la possibilità  di essere utilizzatipossono essere utilizzate in processi industriali di bioraffineria, potendo essere inclusi in mix enzimatici utili alla degradazione di biomasse lignocellulosiche ottenute come scarti dall'industria agroalimentare. Il meccanismo d'azione di questi enzimi ਠtuttora ambiguo e per questo motivo sono necessari molti studi che ne approfondiscano il funzionamento. Da recenti studi si ਠscoperto che le LPMO sono enzimi rame-dipendenti, in grado di catalizzare l'ossidazione per la rottura di legami glicosidici in presenza di un donatore di elettroni (enzimatico o non enzimatico) e di perossido di idrogeno. Lo scopo del lavoro ਠstato quello di produrre, purificare e caratterizzare tre differenti LPMO fungine, una originaria dida Fomitopsis pinicola e due da i Phanerochaete chrysosporium: FpAA14A, PcGH61D e PcCel61D (della classe AA9). La produzione ਠstata svolta attraverso l'espressione eterologa, sfruttando il lievito Pichia pastoris in tre differenti fermentazioni con lo scopo di ottenere considerevoli volumi. A seguito di ogni fermentazione ਠstato eseguito uno o pi๠step di purificazione tramite cromatografia a interazione idrofobica (HIC) e talvolta, tramite cromatografia a scambio anionico (AEX). Al termine di ogni step di purificazione sono stati svolti saggi enzimatici rapidi e consolidati per osservarne la crescente attività  su differenti substrati, come 2,6-dimetilfenolo e/o hydrocoerulignone. La seconda parte del lavoro, invece, si ਠfocalizzata sull'attività  di legame a substrati quali cellulosa microcristallina e phosphoric acid swollen cellulose (PASC). Quest'ultimo esperimento ਠstato svolto in presenza di PcGH61D e in seguito di NcLPMO9C (LPMO da Neurospora crassa), ben caratterizzata in lavori precedenti. Lo scopo di questo esperimento ਠstato quello di osservare il modo in cui legassero le LPMO ai substrati cellulosici con differenti gradi di cristallinità . Originariamente, al posto di NcLPMO9C doveva essere testata la LPMO PcCel61D da P. chrysosporium, ma dopo il primo step di purificazione non era stata trovata alcuna attività  enzimatica. Inoltre, come PcCel61D, l'enzima NcLPMO9C presenta un carbohydrate-binding module (CBM), ovvero un dominio proteico che permette di legare pi๠saldamente un enzima al substrato.