Biodistribuzione di nanofarmaci: set up e ottimizzazione di metodi analitici

Il trattamento delle malattie neurologiche rappresenta una delle sfide pi๠complesse in clinica a causa dell'inabilità  di farmaci potenzialmente efficaci di attraversare la barriera ematoencefalica (BEE), il principale sistema di difesa costruito attorno al sistema nervoso centrale (SNC). Il gruppo Te.Far.T.I. dell'Università  di Modena e Reggio Emilia, con cui ho collaborato per la realizzazione del mio lavoro di tesi sperimentale, ਠda anni impegnato nello sviluppo di approcci innovativi nel trattamento di malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Huntington, un disordine ereditario ancora senza cura i cui sintomi cognitivi e motori sono stati collegati a una riduzione dei livelli celebrali di colesterolo. Essendo il colesterolo incapace di attraversare la BEE, risulta indispensabile formularlo in un drug delivery system (DDS) che gli permetta di raggiungere il SNC in concentrazioni efficaci. Tra tutti i nanovettori resi disponibili grazie agli avanzamenti delle nanotecnologie applicate in campo medico, ci si ਠfocalizzati sullo sviluppo di nanoparticelle (NPs), in particolare nanoparticelle lipidiche interamente costituite da colesterolo, con il duplice ruolo di componente strutturale e principio attivo, e ingegnerizzate per il superamento della BEE. Uno degli aspetti principali da valutare nello sviluppo di un nanocarrier ਠla sua biodistribuzione in seguito a somministrazione sistemica al fine di verificare la sua capacità  di eludere i sistemi di difesa fisiologici e raggiungere il sito target. Pertanto, il mio lavoro di tesi ਠstato principalmente incentrato sulla messa a punto e ottimizzazione di un metodo per valutare la biodistribuzione di nanoparticelle di colesterolo direzionate al cervello, aspetto non ancora esaminato. In particolare, l'obiettivo ਠstato quello di mettere a punto un metodo adatto ad estrarre dai tessuti biologici (omogeneizzazione e estrazione solido-liquido) e quantificare (HPLC) il colesterolo-Cy5, aggiunto nelle formulazioni nanoparticellari per tracciare la loro distribuzione e per distinguere il colesterolo apportato tramite le NPs da quello endogeno. Il metodo di estrazione ਠstato validato lavorando su organi ottenuti da topi non trattati, iniettati poi ex-vivo con quantità  note di colesterolo-Cy5. Sono state indagate diverse variabili operative (tipo e volume di solvente estraente, tempo di contatto, tecniche meccaniche) al fine di ottenere la migliore resa estrattiva. Il metodo ottimizzato ਠstato poi applicato su tessuti ottenuti da topi non trattati e iniettati ex-vivo con NPs di colesterolo-Cy5. In parallelo, sono state poste le basi per un metodo di estrazione e quantificazione (fluorimetria) del PLGA-Cy5, con la prospettiva futura di confrontare la biodistribuzione di nanoparticelle lipidiche e polimeriche. In merito al colesterolo-Cy5, il metodo di estrazione ottimizzato ha reso possibile un recupero prossimo al 100%, sia dal tessuto iniettato con colesterolo-Cy5 libero che con colesterolo-Cy5 NPs, dimostrando la sua abilità  nel disaggregare le nanoparticelle e estrarre l'analita di interesse. Inoltre, sono stati ottenuti risultati comparabili da tutti i diversi tipi di tessuti analizzati (cervello, fegato, milza, rene, polmone), rendendo questo metodo adatto per studi di biodistribuzione in vivo, le cui prime prove sono attualmente in corso. Relativamente al PLGA-Cy5, il metodo di estrazione applicato a PLGA-Cy5 NPs ha permesso un recupero prossimo all'80% con molta variabilità  tra i campioni rendendo necessaria un'ulteriore ottimizzazione, attualmente in corso, al fine di ottenere una resa costante e completa prima dell'applicazione in un futuro studio in vivo.