Sviluppo e validazione di una nuova metodica per lo screening di ligandi delle Fosfodiesterasi (PDE5) tramite FRET (Fà¶rster Resonance Energy Transfer)

La fosfodiesterasi 5 (PDE5) ਠl'enzima responsabile dell'idrolisi del cGMP a 5'-GMP. Il cGMP ਠun messaggero cellulare secondario con un importante ruolo in diversi processi fisiopatologici. Recentemente, diversi gruppi hanno riportato un aumento dell'espressione della PDE5 in diversi tumori quali colon, polmone, seno e melanoma. Quattro sono gli inibitori della PDE5 approvati dalla FDA (Sildenafil, Tadalafil, Verdenafil, Avalafil) prescritti come trattamento dei diversi disordini e di recente ਠemerso un loro possibile uso anche nel meccanismo di sensibilizzazione delle cellule tumorali al trattamento chemioterapico. Data l'emergente importanza della PDE5 in diversi ambiti, numerosi sono gli studi per l'identificazione di nuovi composti in grado di inibirne l'attività . Attualmente vi sono pochi saggi disponibili in commercio per lo screening di ligandi/inibitori della PDE5, tutti basati sull'analisi indiretta di tale legame. Attualmente la metodica maggiormente utilizzata per lo screening di potenziali ligandi ਠbasata sullo spiazzamento di un ligando radioattivo da parte della molecola in esame. Questa tecnica, benchਠmolto sensibile ed accurata, presenta notevoli limitazioni in termini di sicurezza per l'uomo e per l'ambiente oltre ad essere soggetta a rigorose normative e a comportare elevati costi legati allo smaltimento del materiale radioattivo. Alla luce di questi svantaggi, la comunità  scientifica ਠalla ricerca di approcci alternativi che non prevedano l'utilizzo dei radioligandi. Per cui questo lavoro di tesi si pone come scopo quello di mettere a punto un nuovo metodo diretto basato sul fenomeno del trasferimento energetico tra due fluorofori (Fà¶rster Resonance Energy Transfer - FRET) per lo screening di ligandi delle PDEs, che possa rappresentare una valida alternativa all'uso dei ligandi radioattivi. Per fare cià², ਠstato utilizzato il dominio catalitico della PDE5 ingegnerizzato in modo da poter essere coniugato al fluoroforo arseniato FlAsH. ਠstato usato il dominio catalitico di PDE5A2 umana (isomero 2, residui 536-860) di E.coli precedentemente ingegnerizzato con una coda tetra-cisteinica in posizione C-terminale. Tale costrutto permette l'inserimento di un'opportuna sonda fluorescente (FlAsH), costituita da una molecola di fluoresceina funzionalizzata con due atomi di arsenico, in grado di legare, in maniera covalente, gli atomi di zolfo delle Cys presenti sulla proteina. Il costrutto PDE5A2TetraCys-FlAsH ਠrisultato essere stabile e attivo anche in presenza del fluoroforo. E' stata inoltre studiata l'interazione con un analogo strutturale del substrato cGMP coniugato a un fluoroforo accettore di FRET, la Rhodamina: il cGMPs-Rhod, chiamato anche c-Rhod.