Nanosistemi ibridi di Colesterolo e PLGA: studio tecnologico e applicazioni in vitro

Il colesterolo (Col) ਠun lipide steroideo presente in tutte le cellule dell'organismo ed in concentrazione elevata nel cervello, dove svolge un ruolo fondamentale sia dal punto di vista strutturale che funzionale. In tale sede, il Col ਠsintetizzato a livello degli astrociti; la molecola non affluisce attraverso la BEE. In alcune patologie neurodegenerative (corea di Huntington e sindrome di Smith†"Lemli†"Opitz) ਠstata riscontrata una carenza della sintesi endogena di Col cerebrale con conseguenze a livello cognitivo e motorio. In caso di deficit della produzione locale, un'efficace terapia di supplementazione richiede approcci innovativi e tecnologici, come l'impiego di vettori nanometrici ingegnerizzati capaci di superare la BEE ed accumularsi al sito target. Sulla base di queste premesse, durante la mia tesi di Laurea sono stati allestiti e ottimizzati nanosistemi ibridi di PLGA e Col, variando diversi parametri formulativi come il metodo di preparazione (nanoprecipitazione ed emulsione semplice), il tensioattivo, il rapporto tra i componenti del sistema e la tecnica di purificazione, cosଠda ottenere sistemi stabili, con caratteristiche morfologiche, strutturali e dimensionali (valutate mediante analisi PCS, microscopia AFM e STEM, analisi compositiva) adatte alla somministrazione, degradabili e cedibili Col. L'utilizzo del composto terapeutico come elemento strutturale del vettore ਠproposto come metodologia per limitare effetti collaterali connessi all'accumulo a livello periferico e del sito patologico di materiali non funzionali. I campioni che mostravano le migliori caratteristiche, dimensioni medie <280 nm, basso indice di polidispersione (PDI<0,3), stabilità  in sospensione e contenuto di Col >35%, sono stati selezionati ed ingegnerizzati introducendo PLGA modificato con i) molecola fluorescente (rodamina) come tracciante e/o ii) l'eptapeptide simil-oppioide g7, in grado di promuovere il superamento della BEE. I vettori modificati sono stati ampiamente caratterizzati, dimostrando proprietà  strutturali e stabilità  analoghi ai vettori non modificati. I sistemi ottimizzati e selezionati sono stati testati in culture primarie di neuroni ippocampali, in collaborazione con il Prof. Grabrucker (Università  di Ulm, Germania). Tali studi sono volti a valutare la tossicità  dei nuovi vettori e ad individuare i meccanismi coinvolti nell'uptake, cosଠda ipotizzare il destino intracellulare e l'effettiva possibilità  di cessione del Col in compartimenti utili. La buona tollerabilità  dei campioni (modificati e non modificati) ਠstata dimostrata mediante test annessina propidio ed indagine Western Blott di proteine coinvolte nel processo apoptotico. Successivamente l'attenzione si ਠspostata sulla determinazione dell'efficienza di internalizzazione dei vettori ibridi in neuroni e cellule gliali e sull'indagine del meccanismo di ingresso nelle cellule mediante tecniche di immunocitochimica, cosଠda definire eventuali differenze rispetto alle pi๠conosciute e note al gruppo di ricerca nanoparticelle di PLGA e studiare il possibile destino intracellulare. Dimensioni, composizione e caratteristiche superficiali sono risultate determinanti nell'influenzare l'affinità  ed il meccanismo di ingresso cellulare. In particolare, i vettori ibridi non modificati con g7 mostrano modalità  di uptake diverse rispetto alle nanoparticelle di solo PLGA, suggerendo nella composizione ricca in Col un parametro di discriminazione della capacità  di uptake. Tali differenze diminuiscono quando i vettori ibridi sono modificati in superficie con g7, a dimostrazione dell'avvenuta esposizione del peptide in superficie e della sua rilevanza nell'internalizzazione in cellule neuronali (endocitosi clatrina-dipendente e accumulo in vescicole RAb5 positive e lisosomi).