Indagine sul ruolo delle NADPH ossidasi in modelli murini di Distrofia Muscolare di Duchenne

La Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) ਠuna malattia muscolare legata al cromosoma X caratterizzata da una completa carenza di distrofina, causa di danno muscolare scheletrico progressivo e morte prematura. Si sospetta che l'aumento di calcio intracellulare, l'eccessiva perossidazione lipidica e produzione di Specie Radicaliche dell'Ossigeno (ROS) contribuiscano alla patologia della malattia. Le NADPH ossidasi (NOXes) sono state considerate una delle principali fonti di produzione di ROS nella malattia e sono state identificate come sovra-espresse nei muscoli dei topi mdx (il modello murino di DMD); in particolare, dati che provengono dal nostro laboratorio indicano che l'isoforma NOX4 sia la pi๠decisiva nel danno indotto in questa patologia. Per chiarire il ruolo dell'isoforma NOX4 nella patologia sono stati utilizzati e confrontati un modello murino distrofico, il modello N4(D)MC, in cui ਠstata indotta selettivamente nel muscolo scheletrico la rimozione genetica di NOX4, e il suo controllo, il modello (D)MC. Nel modello N4(D)MC l'espressione di NOX4 ਠstata inibita in modo muscolo specifica in seguito ad un breve trattamento con Doxiciclina. La generazione di ROS e la quantificazione di calcio sono stati misurati, attraverso Live Cell Imaging, utilizzando rispettivamente le sonde Cell ROX Deep Red e FURA2-AM, caricate su fibre muscolari del Flexor Digitorum Brevis (FDB) isolate da topi N4(D)MC e (D)MC. Topi distrofici NOX4-deficienti hanno mostrato sorprendenti livelli ridotti di ROS rispetto ai topi DMC (topi distrofici con il gene NOX4 espresso), risultato che dimostra un coinvolgimento di NOX4 nella fisiopatologia della malattia. Anche l'influsso di calcio ਠstato visto essere ridotto nei topi N4DMC, tuttavia non raggiungendo la significatività  statistica. Inoltre, i topi N4DMC hanno dimostrato un'ipertrofia muscolare significativamente ridotta rispetto al fenotipo wild-type e DMC, come visto dal peso dei muscoli estratti da diversi modelli di topi. Questi risultati hanno rafforzato il ruolo centrale svolto da NOX4 nella fisiopatologia della DMD, suggerendo questa isoforma come un target promettente per i futuri approcci terapeutici. Lo studio ha anche esaminato gli effetti di una nuova small molecule, il GSK2795039 (MedChemExpres, USA), inibitore della NOX2, al fine di valutare il suo effetto sullo stress ossidativo incontrato nella malattia. La produzione di ROS ਠstata misurata in miotubi di modelli DMC, utilizzando una delle sonde attualmente pi๠utilizzate, la dicloro-diidro-fluoresceina diacecetato (DCFH-DA). Il lavoro svolto si ਠoccupato inoltre di indagare sugli effetti che il GSK2795039 ha sulla generazione di forza di muscoli Exstensor Digitorum Longus (EDL) isolati, in seguito ad esposizione a contrazioni eccentriche, contrazioni conosciute per essere particolarmente dannose per i muscoli distrofici. Nei miotubi distrofici, il lead compound ha inibito la produzione di ROS rispetto al controllo (miotubi non trattati), raggiungendo lo stesso livello di inibizione della Diapocinina, il nostro composto di riferimento. La Diapocinina, utilizzata come controllo positivo, ਠun inibitore semisintetico delle NADPH ossidasi che ha mostrato grande efficacia in modelli murini distrofici. I risultati ottenuti si sono quindi confermati estremamente incoraggianti. D'altra parte, il GSK2795039 non ha dimostrato di prevenire la perdita di forza indotta da contrazioni eccentriche in muscoli distrofici. A causa del basso numero di muscoli analizzati, saranno necessari perಠulteriori studi per consolidare questi risultati. In conclusione, i nuovi modelli murini generati, N4(D)MC/(D)MC, e il selettivo targeting di NOXes usando small molecules sono stati prova del potenziale che questo target ha nei modelli di DMD. Sono perಠnecessari ulteriori studi per chiarire il suo ruolo nella cascata fisiopatologica della malattia.