Fabbricazione e caratterizzazione di biosensori elettronici organici basati su batteriofagi come elemento di riconoscimento

Il lavoro svolto in questo progetto ha avuto come obbiettivo quello di fabbricare dispositivi elettronici organici con architettura Electrolyte-Gated Field-Effect Transistors (EGOFET) che sfruttassero batteriofagi come macchina biologica per il riconoscimento di E. coli. Il fago M13 fa parte della classe Ff del gruppo dei batteriofagi filamentosi, ਠcostituito da un genoma circolare ssDNA contenuto nel lungo capside proteico, infetta i batteri e ne sfrutta il macchinario di replicazione per riprodursi. L'infezione avviene tramite il riconoscimento del pilo F, responsabile della coniugazione in E. coli, ciಠli rende specifici per alcuni di questi ceppi. Questi fagi sono stati sfruttati come elemento di detection per proteine bersaglio nella costruzione di biosensori EGOFETs. Gli EGOFET sono un particolare tipo di OFET che sfruttano la modulazione della conduttività  di un semiconduttore organico da parte di una soluzione elettrolitica. Si ਠintervenuti sull'interfaccia di uno dei tre elettrodi presenti nel transistor, quello di gate, funzionalizzandola con le particelle fagiche con lo scopo di valutare la presenza di E. coli nella soluzione e, successivamente, a modifiche della composizione del capside, il legame anche con altre molecole bersaglio (endotossina LPS). Il fago M13 wild-type ਠstato inizialmente immobilizzato covalentemente sull'elettrodo di gate, mediante monostrato polimerico autoassemblato (SAM), ਠstato attivato con EDC (composto carbodiimmidico) al fine di promuoverne il legame ammidico con i gruppi amminici esposti delle proteine fagiche. Successivamente grazie alla collaborazione con il prof. Danielli del Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie di Bologna, ਠstata individuata in letteratura la sequenza relativa ad un dodecapeptide legante l'oro ed ਠstata usata per ingegnerizzare le proteine capsidiche pVIII (circa 2700 copie) e pIII (circa 5 copie). àˆ stata anche valutata la strategia per un display ortogonale pIII-pVIII che coinvolgesse oltre al peptide legante l'oro, un altro peptide affine all'endotossina batterica LPS (lipopolisaccaride). I vari step di funzionalizzazione dell'elettrodo di Gate con SAM, M13 wild-type o ricombinante (solo per il Gold binding peptide) sono stati caratterizzati elettrochimicamente ed elettricamente. Entrambe le strategie sono state usate anche per verificare il legame dei fagi con i ceppi TG1 di E. coli (F+), valutando le variazioni nelle risposte a differenti concentrazioni di batterio. Nel primo caso, mediante voltammetria ciclica e spettroscopia di impedenza si valuta l'entità  del ricoprimento dell'elettrodo, rispettivamente in base alla riduzione della superfice accessibile a una sonda redox in soluzione e alla resistenza che questo offre al passaggio di corrente. Nella caratterizzazione elettrica sono state invece valutate le diverse risposte degli EGOFET descritti prima, analizzando le curve di transfer e di output. L'utilizzo di un sistema microfluidico ha permesso, variando la composizione della soluzione elettrolitica, di misurare le variazioni della corrente in uscita dal dispositivo, facendo maggiore chiarezza sulla cinetica di legame tra fago e superficie d'oro e di riconoscimento del medesimo e coli. In conclusione, risulta possibile sfruttare i batteriofagi come elemento per la detection di batteri sfruttando le interazioni fisiologiche alla base del meccanismo di riproduzione fagica; ma anche nuove interazioni con molecole esogene grazie alle potenzialità  del Phage Display che permette un'ingegnerizzazione mirata delle proteine capsidiche.