Studio e ruolo di Fas/Fas-L nell'immunomodulazione delle cellule staminali della polpa dentale umana

Le cellule staminali della polpa dentale umana o hDPSC si trovano nel tessuto connettivo lasso alloggiato nella camera pulpare. Le hDPSC hanno un alto tasso di proliferazione, una bassa immunogenicità  e un'elevata capacità  di differenziare in diversi lineages, quali: osteogenico, condrogenico, adipogenico, miogenico e neurale. La capacità  di multi/pluri potenza delle hDPSC ਠda attribuirsi alla loro particolare derivazione embrionale dalla cresta neurale. Queste peculiarità  rendono le hDPSC molto interessanti nel campo della medicina rigenerativa. Come ਠgià  noto, le hDPSC sono in grado di indurre l'apoptosi dei linfociti CD4+ e CD8+. In particolare, l'immunoregolazione operata dalle hDPSC ਠassociata ad una "up-regolazione" dell'espressione di Fas ligando (Fas-L, CD95-L), importante proteina transmembrana che gioca un ruolo rilevante nell'induzione dell'apoptosi tramite l'attivazione del pathway Fas recettore (Fas, CD95, recettore di morte cellulare). Come riportato in letteratura il Fas-L ਠespresso anche nei linfociti CD4+, CD8+, che utilizzano il pathway Fas/Fas-L in maniera autocrina e paracrina. Dagli studi condotti ਠstato osservato che le hDPSC sono in grado di esprimere anche il Fas. L'espressione del Fas nelle hDPSC non corrisponde all'attivazione del processo apoptotico nelle stesse. Lo scopo della mia ricerca ਠstato quello di indagare i meccanismi alla base dell'inibizione della cascata apoptotica associata alla stimolazione del Fas e successivamente di studiare il ruolo del Fas-L nei processi di differenziamento in senso condrogenico nelle hDPSC. Le hDPSC sono state isolate da polpe dentali sane (n=3) tramite disgregazione meccanica e sono state immunoselezionate mediante magnetic cell sorting (MACS) per gli antigeni di superficie c-Kit e STRO-1. In seguito, abbiamo condotto esperimenti di co-coltura di PBMC-hDPSC. Dall'analisi citofluorimetrica si ਠriscontrato un aumento significativo di CD4+ e CD8+ apoptotiche (P<0,05 PBMC-hDPSC in co-coltura vs PBMC coltivate da sole). Allo stesso tempo sperimentale, dall'analisi in Western Blot si ਠosservato un aumento significativo dell'espressione di Fas-L nelle hDPSC. In seguito a co-coltura, le hDPSC non mostravano segni di sofferenza, quindi, sono stati indagati i processi alla base dell'attivazione del pathway del Fas/FasL nelle hDPSC stimolate con diverse concentrazioni della proteina ricombinante FasL, per 24 ore. Successivamente sono stati valutati gli effetti della stimolazione sulla vitalità  cellulare, sulla proliferazione e sui meccanismi dell'attivazione della via estrinseca dell'apoptosi nelle hDPSC. In particolare, dal MTT assay si ਠosservato un aumento della vitalità  cellulare nei gruppi sperimentali trattati con FasL, in modo dose dipendente, rispetto al controllo e rispetto al gruppo di hDPSC trattate con l'inibitore di FasL. Tramite analisi di Western Blot e di immunofluorescenza confocale ਠstato rilevato un aumento significativo dell'espressione di PCNA e di c-FLIP(L) rispetto sia al gruppo di controllo che al gruppo trattato con l'inibitore (P<0,05). All'aumentare dell'espressione di c-FLIP nelle hDPSC trattate con la dose maggiore di Fas-L si ਠosservata una diminuzione dell'espressione del Fas (P<0,05 vs gruppo controllo). Dato degno di nota ਠl'espressione dei markers tipici del differenziamento in senso condrogenico, rilevati tramite analisi di Western Blot e immunofluorescenza, nelle hDPSC a due settimane dallo stimolo. Allo stesso tempo sperimentale si ਠosservato un aumento dell'espressione di Fas-L. Questo indica come il pathway Fas/FasL ਠimplicato sia nell'immunomodulazione che nel differenziamento delle hDPSC.