Set up ed ottimizzazione di un protocollo per l'estrazione e la quantificazione della curcumina rilasciata da nanoparticelle in tessuto cerebrale

La curcumina (curc), il principale componente attivo della Curcuma Longa, ਠuna molecola con un ampio spettro di attività  farmacologiche, come quelle antiinfiammatoria ed antiossidante, e la possibile capacità  di rallentare o inibire l'aggregazione di talune proteine; tali proprietà  potrebbero essere sfruttate in patologie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson. L'utilizzo terapeutico di curc ਠperಠostacolato dalla sua farmacocinetica: si tratta di una molecola poco solubile nei fluidi biologici (0,6 µg/mL in acqua) che viene rapidamente metabolizzata ed eliminata, e quindi con scarsa biodisponibilità . Inoltre ha una bassa capacità  di attraversare la barriera emato-encefalica (BEE) con la conseguenza di insufficienti dosi terapeutiche efficaci nel distretto cerebrale. Il gruppo di ricerca Te.Far.T.I con cui ho collaborato, ha recentemente messo a punto una tecnica per stabilizzare la curc in nanoparticelle polimeriche (NPs) costituite da un polimero biocompatibile e biodegradabile (polilattico-co-glicolico) opportunamente ingegnerizzate in superficie con l'eptapeptide g7. Tali NPs sono state testate in numerosi esperimenti in vivo su modelli murini e se ne ਠdimostrata la capacità  di superare la BEE e raggiungere il Sistema Nervoso Centrale (SNC). In questa tesi mi sono occupata della messa a punto di un metodo di estrazione e di quantificazione di curc da tessuti animali: tale protocollo ਠindispensabile per verificare la capacità  dei sistemi ottimizzati di trasportare l'attivo al SNC. Inizialmente il lavoro si ਠconcentrato sulla messa a punto del metodo. Sono stati analizzati tessuti †œbianchi†�, ovvero prelevati da animali non sottoposti a trattamento con NPs, addizionati ex vivo con quantità  note di curc. I campioni sono stati sottoposti a protocolli di estrazione liquido-liquido variando differenti parametri operativi (tipo di solvente, rapporti tra fase acquosa ed organica, tempi di contatto, modalità  di estrazione). Lo studio ha permesso di identificare le condizioni ottimali per l'estrazione ed il raggiungimento di elevate rese di estrazione (>80%), a cui poi ਠseguito un processo di purificazione accoppiato (centrifugazione-filtrazione). La quantificazione di curc nell'estratto ਠstata effettuata mediante un'analisi in RP-HPLC accoppiata a rivelatore UV, condotta in modalità  isocratica e validata in termini di linearità , precisione, accuratezza e robustezza. La validazione del metodo in campioni †œtrattati†� ha costituito il secondo obiettivo: si ਠproceduto all'analisi di cervelli prelevati da animali, provenienti da diversi gruppi sperimentali, sottoposti a trattamento con NPs polimeriche a differenti dosi (0.5, 0.1, 0.01 mg di NPs corrispondenti a 16, 3.2, 0.32 µg di curc rispettivamente), e a differenti tempi di sacrificio (1, 3, 6, 13, 24 ore). Un primo rilevante risultato consiste nell'evidenza che il metodo di estrazione e quantificazione si ਠrivelato sufficientemente robusto per l'analisi e la quantificazione di curc all'interno del SNC dopo somministrazione con NPs. Inoltre, i dati sperimentali dimostrano come le NPs ingegnerizzate con il peptide direzionante (g7-NPs-curc) siano le pi๠efficienti nel trasportare l'attivo al cervello, con un picco (3 volte maggiore del controllo con NPs non ingegnerizzate) dopo 6 ore dalla somministrazione. Tale accumulo risulta proporzionale alla dose iniettata e massimale dopo trattamento con 0.5 mg di NPs per animale. Sulla base di questi dati sono attualmente in corso trattamenti cronici (28 giorni di trattamento, 0.5 mg di NPs per dose) su animali patologici (topi 5*FAD, modelli di AD) su cui verrà  quantificata la curc totale accumulata nel cervello e l'azione farmacologica (inibizione dell'aggregazione ed effetto antiinfiammatorio).