Studio dei loci MAT e dell'identità cellulare in un lievito ibrido tramite sequenziamento genomico MinION, validazione tramite PCR ed espressione genica.

Riassunto I lieviti ibridi apportano vantaggi alle fermentazioni industriali, tra cui robustezza, migliore produzione di sottoprodotti e maggiore resistenza allo stress rispetto alle specie parentali. L'ibridazione interspecifica guida rapidi eventi di speciazione e fornisce plasticità  genomica per nuove opportunità  adattive. Pertanto, la comprensione della struttura dei genomi ibridi ਠrilevante sia per la biologia applicata che per quella evolutiva. Tuttavia, l'elevata eterozigosità  e il mosaicismo tra gli aplotipi parentali ostacolano l'assemblaggio de novo basato su reads corte di tali genomi. Nel clade Zygosaccharomyces rouxii, l'ibridazione ਠfrequente, con ricombinazioni tra aplotipi parentali a livello dei loci Mating type like (MTL), che definiscono l'identità  cellulare e la competenza alla meiosi. Le cellule aploidi hanno un sistema a tre cassette: una ਠil locus MAT trascrizionalmente attivo, mentre due sono i donatori silenti HMR e HML. I loci MTL includono due alleli mating-type, Yα e Ya, fiancheggiati dalle regioni ripetute X e Z. Questa struttura ਠdifficile da risolvere con reads brevi che non possono estendersi sulle intere cassette MTL ancorandosi ai geni fiancheggianti. Rispetto agli aploidi, gli ibridi hanno un numero pi๠elevato di loci MTL e cassette chimeriche che ostacolano ulteriormente la ricostruzione degli MTL mediante un assemblaggio de novo con reads corte. Recentemente, Oxford Nanopore Technology ha commercializzato il dispositivo MinION, un sequenziatore portatile di terza generazione che fornisce reads ultra-lunghe a basso costo. Le reads ultra-lunghe si estendono su lunghe regioni ripetute e varianti di sequenza, che difficilmente possono essere risolte con reads brevi. Nella presente tesi, abbiamo analizzato il †˜draft genome', basato sull'assemblatore DBG2OLC, del ceppo ATCC42981, un lievito ibrido con un'eccezionale alotolleranza, ma incapace di svolgere meiosi a causa della presenza di 2 subgenomi divergenti, T e P. Questo assemblaggio combina lunghe reads MinION con reads brevi paired-end Illumina generando 33 scaffold. La nostra ricerca ha rivelato che ATCC42981 contiene 8 loci MTL (2 MTLαT, 4 MTLαP e 2 MTLa): questa disposizione richiama solo parzialmente sia i nostri risultati precedenti (Bizzarri et al., 2016), sia l'assetto MTL descritto in JCM22060, la stock giapponese di ATCC42981. Per escludere †˜misassembles', abbiamo validato le cassette MTL dell'assemblaggio DBG2OLC in silico usando l'assemblatore alternativo MaSuRCA, cosଠcome in vitro tramite PCR e sequenziamento Sanger. Abbiamo dimostrato che ATCC42981 presenta diversi loci MTL chimerici frutto della traslocazione reciproca tra gli aplotipi T e P nella regione X e che ha due loci trascrizionalmente attivi MATa/MATαP, in contrasto con l'unico locus espresso MATαP trovato in JCM22060. Coerentemente, JCM22060 ma non ATCC42981 si comporta come aploide e svolge mating e meiosi. Per studiare i meccanismi che definiscono l'identità  cellulare negli ibridi, abbiamo condotto RT-PCRs per geni a-specifici sia in MATa/ MATαP ATCC42981 wt e in deleti emizigoti MATa/-. Abbiamo scoperto che la delezione di MATαP disattivava la trascrizione di a2, un attivatore di geni a-specifici. Indipendentemente dall'inattivazione di a2, i geni a-specifici sono stati trascritti in modo improprio sia in cellule MATa/MATαP wt che in cellule emizigoti MATa/-. In conclusione, questa tesi ha dimostrato che: 1) un approccio integrato basato su algoritmi di assemblaggio indipendenti e validazione PCR/Sanger ਠadatto a risolvere definitivamente l'assetto dei loci MTL in ATCC42981; 2)i loci MTL sono fonte di instabilità  genomica, generando diversità  fenotipiche (competenza/incompetenza alla meiosi) in copie distinte dello stesso ceppo; 3) i circuiti regolatori dell'identità  cellulare potrebbero divergere negli ibridi Z. rouxii rispetto ad altre specie, meritando ulteriori studi in futuro.