Studio della relazione tra ritmo circadiano periferico e azione delle gonadotropine

La riproduzione ਠcaratterizzata da una ritmicità  di eventi regolata da gonadotropine, ormoni steroidei e fattori ambientali. Nei mammiferi, la secrezione dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) nel sistema portale avviene con un'ampiezza e ad una cadenza ben precisa, indotta dalla trascrizione ritmica dei geni “clock”. Questi geni sono espressi sia a livello del sistema nervoso centrale, sia nell'ovaio, dove regolano steroidogenesi, follicologenesi e ovulazione. Lo scopo del presente studio ਠquello di investigare il ruolo modulatorio della trascrizione ritmica dei geni clock sulla cinetica di attivazione del recettore dell'ormone luteinizzante (LH) e della gonadotropina corionica umana (hCG) (LHCGR), nonchਠdegli eventi intracellulari modulati da queste due gonadotropine. Cellule primarie della granulosa umane (hGLC), naturalmente esprimenti LHCGR, sono state stimolate con LH o hCG (1 e 0,1 nM, rispettivamente) in esperimenti time-course (0-24 ore). L'espressione dei geni clock (PER1, PER2, ARNTL, CLOCK), geni legati alla steroidogenesi (STARD1 e CYP19A1), alla risposta alle gonadotropine (LHCGR e LHCGR LHCGR-exon 6A), al ciclo cellulare (CCDN2) e EGF-like factors (AREG e EREG) sono stati valutati mediante real time PCR. La produzione ciclica di cAMP intra- ed extra-cellulare, l'espressione della proteina Gαs, β-arrestin 1/2, LHCGR e la fosforilazione di extracellular-regulated kinase (ERK1/2) sono stati analizzati mediante ELISA e Western blotting. Inoltre, la localizzazione delle proteine Gαs, β-arrestin 1/2, LHCGR e le modificazioni morfologiche cellulari indotte dalla stimolazione con LH o hCG sono state valutate mediante immunofluorescenza. Dall'analisi emerge che il trattamento con le gonadotropine ਠin grado di perturbare la naturale ciclicità  dei geni CLOCK e ARNTL cosଠcome STARD1, CYP19A1, LHCGR ed alcune sue varianti trascrizionali (LHCGR-exon 6), la cui trascrizione ਠregolata dagli stessi geni clock. Il trattamento non influenza l'espressione dei geni PER1 e PER2, quest'ultimo implicato nell'inibizione dell'attività  del complesso BMAL1:CLOCK. L'analisi mediante Western blotting rivela la sovra-espressione e down-regolazione delle proteine Gαs e β arrestin 1/2 nell'arco di 24 ore, rispettivamente coinvolte nella attivazione della cAMP/PKA pathway e nella desensibilizzazione/internalizzazione del recettore. Anche la fosforilazione di ERK 1/2 indotta da entrambi i trattamenti segue un andamento ciclico. Dall'osservazione al microscopio a fluorescenza emerge che il trattamento con le gonadotropine dopo 17 h determina alterazione morfologica delle cellule e comparsa di vacuoli intracitoplasmatici, causata dall'attivazione della cAMP/PKA pathway. Tale via di trasduzione del segnale ਠassociata ad eventi steroidogenici e pro apoptotici. Queste modificazioni sono accompagnate dall'internalizzazione del recettore e dalla traslocazione di Gαs nel citoplama nonostante la presenza di oscillazioni di cAMP ogni 3-5 h. I risultati mostrano una relazione tra ritmo circadiano ed eventi di trasduzione del segnale in seguito all'attivazione del recettore indotta dalle gonadotropine. Il ruolo del ritmo circadiano nell'ovulazione, nella steroidogenesi e nella follicologenesi rende questi dati utili per la comprensione dei meccanismi fisiologici della riproduzione.