Gene editing allele-specifico su cheratina 14 in una forma dominante di Epidermolisi Bollosa Simplex attraverso il sistema CRISPR-Cas9

Epidermolisi Bollosa Simplex comprende un gruppo di malattie genetiche della pelle caratterizzate dalla comparsa di lesioni bollose, localizzate o sparse in tutto corpo, provocate in seguito all'esposizione a stress meccanico anche lieve. Questa fragilità , che colpisce la parte superficiale della pelle, ਠdovuta a uno scollamento non fisiologico tra i cheratinociti epidermici proliferanti, come risultato di mutazioni nei geni codificanti le cheratine dello strato basale, come la cheratina 14. Questa patologia ਠdi gran lunga la forma pi๠comune di Epidermolisi Bollosa ereditaria e, nonostante si presenti con un fenotipo generalmente leggero, viene comunque percepita come una condizione grave e debilitante, che porta a una scarsa qualità  della vita. Per cui, l'identificazione di approcci terapeutici promettenti potrebbe sollevare speranze per lo sviluppo in futuro di trattamenti a lungo termine che portino beneficio a un gran numero di pazienti nel mondo. Data l'alta prevalenza di forme dominanti, abbiamo delineato una strategia di gene editing allele-specifica su cellule primarie umane di Epidermolisi Bollosa Simplex, caratterizzate da una delezione monoallelica di 21 nucleotidi nell'esone1 del gene KRT14. Questo approccio in vitro ਠstato attuato attraverso il sistema CRISPR-Cas9, programmato con un RNA guida accuratamente disegnato. Il lavoro della mia tesi mira a inattivare esclusivamente l'allele mutato, sfruttando l'attività  nucleasica di CRISPR-Cas9 per indurre rotture a doppio filamento nel DNA genomico, che successivamente stimolino i meccanismi di riparo della cellula, tra cui quello di ricombinazione non omologa. Piccole inserzioni o delezioni introdotte da questo sistema di riparo del DNA generano mutazioni frameshift che portano all'abolizione dell'espressione dell'allele patogeno. Di seguito mostriamo come la nostra strategia di gene editing abbia avuto successo nel sopprimere l'espressione del gene KRT14 difettivo, permettendo il pieno ripristino del normale fenotipo cellulare, dovuto alla presenza dell'allele wild-type. àˆ da sottolineare, inoltre, come la notevole efficacia e specificità  allelica siano associate anche a un buon profilo di sicurezza, valutato tramite un'analisi in silico degli off targets. In conclusione, i risultati incoraggianti realizzati tramite questo approccio pongono le basi per sviluppi futuri, mirati a ulteriori ottimizzazioni, per una eventuale prossima applicazione clinica.