Purificazione delle proteine coinvolte nell'aggregazione amiloide

La comprensione a livello molecolare dei meccanismi che portano alla formazione di forme amiloidi e l'impatto che hanno sulle malattie degenerative ਠdi importanza fondamentale per future strategie terapeutiche. L'obiettivo di questo studio ਠstato quello di ottimizzare le strategie standard di purificazione delle proteine coinvolte nell'aggregazione amiloide. Le proteine oggetto di studio sono state proteine ricombinanti progettate per includere una sequenza proteica o peptidica (fusion tag). Lo scopo di utilizzare i fusion tag ਠquello di migliorare l'espressione delle proteine ricombinanti e di risolvere alcuni problemi relativi alle procedure di purificazione delle proteine stesse. I tag proteici di alcune proteine purificate sono stati mBp (maltose-Binding protein) e GST (glutathione S-transferase), mentre il tag peptidico presente nella maggior parte delle proteine ਠstato His6-tag. I metodi di purificazione utilizzati a questo scopo sono stati: cromatografia di affinità , a scambio ionico e ad esclusione dimensionale. La scelta di un adeguato metodo di purificazione ਠstata fatta in funzione della sola proteina e in modo da garantire una buona resa. Durante il periodo di studio sono state trasformate, espresse e purificate in alta concentrazione otto proteine note per essere coinvolte nell'aggregazione amiloide: Hsp90; α-Sinucleina; TIA1 e altre due isoforme di TIA1, mBpTIA1FL (Full Length) e mBpTIA1LC (regione a bassa complessità ); hnRNPA1; SERF1a; e TDP-43. La trasformazione e l'espressione delle proteine citate sono avvenute nel modello batterico Escherichia Coli, ceppo BL21. I risultati ottenuti in seguito alla purificazione hanno dimostrato un'efficacia del metodo adoperato. La concentrazione ottenuta per Hsp90, nonostante il procedimento applicato sia risultato dispendioso in termini di tempo, ਠstata 0,775 mg/mL. Il metodo standard di purificazione di TIA1 ਠrisultato poco efficiente a causa della sua bassa solubilità . Infatti, per ottenere una concentrazione di 4,2 mg/mL ਠstato necessario ricorrere alla dialisi e successivamente denaturare la proteina in un buffer 8M urea. La purificazione di mBpTIA1FL ha fornito un risultato di 4.538 mg/mL mentre l'isoforma mBpTIA1LC ਠstata ottenuta in una concentrazione di 1,77 mg/mL. Le concentrazioni elevate ottenute delle rispettive proteine ha evidenziato la loro tendenza all'aggregazione. L'isoforma Full Length della proteina TIA1 ha mostrato una tendenza a formare delle fibre in seguito al taglio proteolitico dalla proteina di fusione mBp. L'isoforma con la regione a bassa complessità , invece, ha formato dei gel simili agli amiloidi probabilmente pi๠instabili anche in presenza del tag mBp. hnRNPA1 ha raggiunto una concentrazione di 0,677 mg/mL e la proteina TDP-43, fusa al tag GST, una concentrazione di 0,983 mg/mL. La purificazione di α-Sinucleina e SERF1a ha dato una resa di 0,524 mg / mL e 1 mg / mL, rispettivamente. La purificazione delle proteine sopra menzionate ਠda considerarsi uno step cruciale e fondamentale per successivi studi di legame, folding e aggregazione, nonchà© per studiare il comportamento delle proteine associate alle malattie neurodegenerative. Di fatto, due delle proteine purificate, α-Sinucleina e SERF1a, sono state l'oggetto di una ricerca condotta dal Dr. Fabio Falsone, dove viene posta l'attenzione sulla conformazione estremamente disordinata della proteina SERF1a. Da questo studio emerge che SERF1a, da una parte, viene identificata come proteina che lega e organizza l'RNA (RNA-binding protein); e dall'altra parte invece, in determinate condizioni, forma un complesso con α-Sinucleina molto dannoso. Il complesso induce la proteina α-Sinucleina alla polimerizzazione e formazione di aggregati amiloidi tossici intraneurale molto diffusi nelle malattie neurodegenerative. Questi studi risultano essere determinanti per l'identificazione e sviluppo di nuovi approcci diagnostici e terapeutici.