Analisi degli eventi precoci nella cascata di attivazione di cAMP/PKA-pathway mediata da LH e hCG

L'ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) sono due ormoni che, nella donna in età  fertile, hanno differenti funzioni fisiologiche. LH regola la gametogenesi, l'ovulazione e la produzione di ormoni steroidei, mentre hCG ਠl'ormone che supporta la gravidanza. Entrambe le molecole agiscono sullo stesso recettore (LHCGR) appartenente alla famiglia dei recettori accoppiati a proteina G, che nell'ovaio ਠespresso dalle cellule della granulosa e dalle cellule della teca. Attraverso il legame tra hCG/LH con il recettore vengono attivate diverse vie di trasduzione del segnale mediate dalle subunità  delle proteine Gαs, Gαi e Gαq oppure di β-arrestine. Una cascata di trasduzione del segnale ਠla cAMP/PKA-pathway, mediata da Gαs, la quale agisce attivando l'adenilato ciclasi, un enzima deputato alla produzione di cAMP. L'aumento di cAMP intracellulare induce l'attivazione della proteina chinasi A (PKA), la quale fosforila e attiva cAMP-responsive element binding protein (pCREB). Precedenti esperimenti hanno rivelato che hCG ਠpi๠potente di LH nell'indurre l'attivazione di cAMP. Lo scopo di questa tesi ਠquello di confrontare la cinetica degli eventi precoci nella cascata di attivazione della cAMP/PKA-pathway mediata da hCG e LH, quali l'attivazione delle proteine G e il reclutamento della β-arrestina. Lo studio in vitro ਠstato effettuato mediante stimolazione continua con gonadotropine di cellule della granulosa umane (hGLC), esprimenti endogenamente LHCGR, e la linea cellulare HEK293 trasfettata con il recettore. L'accumulo di cAMP intracellulare ਠstato valutato mediante metodiche di bioluminescence resonance energy transfer BRET in HEK293, in presenza e in assenza di un inibitore dell'internalizzazione mediata da clatrina chiamato †œDynasore†�. Tramite la metodica BRET sono state valutate anche le cinetiche di associazione al recettore di Gαs e di β-arrestina. La cinetica di fosforilazione di CREB ਠstata valutata in hGLC mediante Western blotting, anch'essa in presenza e in assenza dell'inibitore dell'internalizzazione. I risultati ottenuti hanno evidenziato differenze nella cinetica di accumulo di cAMP indotto da hCG e LH durante le prime due ore di trattamento, la quale raggiunge valori pi๠alti in funzione di stimolazione con hCG rispetto all'altro ormone. La cinetica di associazione tra LHCGR e proteina Gαs, β-arrestina e attivazione di pCREB non ha rivelato differenze significative tra il trattamento con LH e hCG. Questo studio ha dimostrato LH e hCG inducono simile attivazione della risposta cellulare a breve termine, in cellule esprimenti LHCGR.