Recettore TMEM97/Sigma-2: clonaggio, espressione e studi di microscopia confocale in presenza del ligando fluorescente BS148-fluo, agonista potente e selettivo del recettore sigma-2

I recettori Sigma, inizialmente classificati come appartenenti alla classe dei recettori degli oppioidi, sono oggi riconosciuti come una classe a se stante, suddivisa in due sottotipi, sigma-1 e sigma-2. Tra i numerosi recettori descritti farmacologicamente durante il XX secolo, quasi tutti sono stati clonati alla fine degli anni '90, incluso il recettore sigma-1. Il recettore sigma-2 ha rappresentato una delle poche eccezioni, tanto da essere definito recettore enigmatico. Questa proteina ਠattualmente oggetto di un rinnovato interesse in quanto si ਠdimostrata essere coinvolta in numerose patologie neurodegenerative come la schizofrenia, il morbo di Alzheimer e il cancro. Recentemente (3 luglio 2017), utilizzando un approccio di tipo biochimico, un team statunitense, ha identificato il recettore sigma-2 come TMEM97, una proteina trans membrana presente nel reticolo endoplasmatico. La scoperta dell'identità  molecolare del recettore sigma-2 ha permesso di includere questo bersaglio molecolare nell'era moderna del drug discovery, consentendo strategie pi๠efficaci per la progettazione mirata di nuovi farmaci. Il mio progetto di tesi sperimentale, inserito all'interno del progetto FAR, si ਠsvolto in due fasi distinte, ciascuna con obiettivi specifici. La prima parte si ਠfocalizzata sulla clonazione e purificazione del recettore sigma-2. Ad oggi, nessun gruppo di ricerca ha ancora pubblicato la struttura cristallografica di questa proteina. Tuttavia, la conoscenza della sua struttura tridimensionale ਠil punto di partenza necessario per la progettazione razionale di nuovi ligandi, attraverso il classico approccio di structure-based drug design . Usando il sistema di espressione Bac to Bac abbiamo espresso il gene TMEM97. Il gene TMEM97 ਠstato clonato in un plasmide donatore pFASTBac e il plasmide ricombinante ਠstato trasformato nelle cellule competenti DH10BAC, contenenti il genoma baculovirale (bacmid) e un plasmide helper. Le colonie contenenti bacmid ricombinante sono state selezionate ed usate per transfettare le cellule di insetto sf9. L'espressione della proteina TMEM97/sigma-2 ਠstata confermata dall'analisi Western blot. La mia seconda parte del progetto di tesi ha avuto come obiettivo la comprensione del meccanismo di azione del composto BS148, un potente agonista del recettore sigma-2 che ha mostrato un'attività  antiproliferativa selettiva verso la linea cellulare di melanoma maligno metastatico (SK-MEL2), con una tossicità  trascurabile nei confronti dei melanociti sani e delle cellule di melanoma primario (SK-MEL28). àˆ noto da letteratura che gli agonisti del recettore sigma-2 sono in grado di uccidere le cellule tumorali, che presentano livelli di espressione del recettore sigma-2 10 volte superiori rispetto alle cellule quiescenti. Questo obiettivo ਠstato perseguito utilizzando una combinazione di tecniche di microscopia confocale e Western Blot. Il ligando fluorescente BS148 ਠstato utilizzato per esaminare la presenza del recettore sigma-2 nelle cellule SK-MEL2, SK-MEL28, melanociti, cellule Hela transfettate con pCMV-TMEM97 e una linea cellulare di controllo positiva, MCF7 (cellule tumorali mammarie umane). Le cellule sono state coltivate e trattate con una concentrazione pari a 100 nM di BS148-fluo per 1 e 24 ore, a 37 ° C, e l'intensità  di fluorescenza ਠstata analizzata mediante analisi di microscopia confocale. Le immagini di microscopia confocale hanno mostrato che BS148-fluo si accumula in tutti i tipi di cellule, localizzandosi principalmente nella regione perinucleare e nel citoplasma. Questo risultato avvalora l'idea che il recettore sigma-2 possa rappresentare un bersaglio innovativo per la diagnosi, il monitoraggio e la cura del cancro.